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Biology

Préparation de suspension unicellulaire de l’intestin de tilapia du Nil pour séquençage unicellulaire

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64688
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea,Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery,Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science,Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine,Suez Canal University

Summary

Ici, nous démontrons la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia pour le séquençage unicellulaire.

Abstract

Le tilapia du Nil est l’une des espèces de poissons d’eau douce les plus couramment cultivées dans le monde et constitue un modèle de recherche largement utilisé pour les études sur les poissons d’aquaculture. La préparation de suspensions unicellulaires de haute qualité est essentielle pour les études au niveau unicellulaire telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire ou du génome. Cependant, il n’existe pas de protocole prêt à l’emploi pour les espèces de poissons d’aquaculture, en particulier pour l’intestin du tilapia. Les enzymes de dissociation efficaces varient en fonction du type de tissu. Par conséquent, il est essentiel d’optimiser le protocole de dissociation tissulaire en sélectionnant l’enzyme ou la combinaison d’enzymes appropriée pour obtenir suffisamment de cellules viables avec un minimum de dommages. Cette étude illustre un protocole optimisé pour préparer une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil avec une combinaison enzymatique de collagénase/dispase. Cette combinaison est très efficace pour la dissociation avec l’utilisation de l’albumine sérique bovine et de la DNase pour réduire l’agrégation cellulaire après digestion. La sortie de cellule répond aux exigences de séquençage de cellules uniques, avec une viabilité cellulaire de 90% et une concentration élevée de cellules. Ce protocole peut également être modifié pour préparer une suspension unicellulaire provenant des intestins d’autres espèces de poissons. Cette recherche fournit un protocole de référence efficace et réduit le besoin d’essais supplémentaires dans la préparation de suspensions unicellulaires pour les espèces de poissons d’aquaculture.

Introduction

Les cellules sont les unités fondamentales des organismes. Par rapport aux études sur les tissus en vrac, les études au niveau d’une seule cellule peuvent refléter l’hétérogénéité cellulaire et fournir des informations à plus haute résolution1. Au cours des dernières années, les chercheurs ont appliqué des technologies de séquençage unicellulaire pour des études sur le génome, le transcriptome, l’épigénome ou multi-omiques au niveau unicellulaire chez des mammifères, des poissons-zèbres et d’autres organismes modèles et ont signalé de grandes percées 2,3,4,5,6,7 . Bien que la plupart des études se soient concentrées sur des organismes modèles, il existe peu de protocoles de référence ou de trousses de dissociation commerciales pour le séquençage unicellulaire chez les espèces de poissons économiques, ce qui limite l’application du séquençage unicellulaire dans la recherche aquacole. Par conséquent, il est crucial de développer des protocoles de dissociation tissulaire qui produisent des suspensions unicellulaires de haute qualité avec une viabilité cellulaire élevée et une intégrité des acides nucléiques.

Il est essentiel d’optimiser le protocole de dissociation tissulaire avec l’enzyme ou la combinaison enzymatique appropriée pour obtenir suffisamment de cellules viables avec un minimum de dommages. L’enzyme la plus efficace pour la dissociation tissulaire varie en fonction du type de tissu. Chez les mammifères, plusieurs enzymes ont été utilisées pour préparer des suspensions unicellulaires pour les tissus solides des mammifères, notamment la collagénase, la dispase, la trypsine, la papaïne, l’élastase, la hyaluronidase, la liberase, l’accutase et la trypLE 8,9. La digestion de la trypsine combinée à une perturbation mécanique a été couramment utilisée pour dissocier les tissus pour la culture cellulaire chez les poissons 10,11,12,13,14. La trypsine a également été utilisée ou ajoutée dans le cocktail de digestion pour la dissociation des tissus dans l’intestin du rat15 et le tissu branchial du poisson zèbre16. Cependant, pour plusieurs raisons, la trypsine n’est pas la meilleure option pour le séquençage unicellulaire. La trypsine seule est généralement inefficace pour la dissociation tissulaire. De plus, la trypsine induit des ruptures de brinsd’ADN 17,18 et une dégradation de l’ARN 19.

La papaïne dégrade les protéines qui composent les jonctions serrées entre les cellules. Dans les cellules nerveuses et musculaires lisses des mammifères, la papaïne est plus efficace et moins destructrice que les autres protéases20,21. Cependant, comme la trypsine, la papaïne entraîne l’agrégation libre des cellules induite par l’ADN en raison de la lyse cellulaire qui se produit pendant la digestion enzymatique9. L’élastase décompose l’élastine, qui se trouve généralement dans la peau, les poumons, les ligaments, les tendons et les tissus vasculaires22. Il est souvent utilisé en association avec la collagénase, la dispase, ou la trypsine pour dissocier le tissu pulmonaire8. La hyaluronidase clive les liaisons glycosidiques de l’hyaluronane, contribuant à la digestion de la matrice extracellulaire dans divers tissus conjonctifs et la peau 9,23.

En général, la collagénase et la dispase sont de bonnes options pour la dégradation de la matrice extracellulaire. Ils ont été utilisés dans la dissociation des intestins humains, de souris et de poisson zèbre24,25,26,27. La collagénase détruit la liaison peptidique dans le collagène, favorise la digestion de la matrice extracellulaire et libère les cellules en suspension, et, par conséquent, la collagénase est souvent utilisée pour la dissociation des tissus solides humains et murins, y compris pour le foie 28,29, la rate30, le pancréas31 et l’intestin 25. La dispase est une protéase qui hydrolyse les liaisons peptidiques N-terminales des résidus d’acides aminés non polaires et est plus douce que la collagénase. Il clive les composants de la matrice extracellulaire, tels que la fibronectine, le collagène de type IV et, dans une moindre mesure, le collagène de type I, sans affecter les jonctions cellule-cellule. Dispase est utilisé séparément ou avec d’autres enzymes pour la dissociation tissulaire, comme pour l’intestin25,32, le cerveau33, le foie34, etc. En outre, les cocktails de digestion disponibles dans le commerce, y compris la liberase, l’accutase et le trypLE, sont également de bonnes alternatives pour la dissociation des tissus solides, en particulier pour la peau, le foie et les reins 8,9.

Le tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) appartient à la famille des Cichlidae de l’ordre des Perciformes. C’est l’une des espèces de poissons d’eau douce les plus cultivées dans les zones tropicales et subtropicales, avec une production annuelle de 4,5 millions de tonnes en 202235. C’est l’une des espèces de poissons d’aquaculture les mieux étudiées avec un génome bien annoté. Le tilapia du Nil est un modèle de recherche idéal pour les espèces de poissons d’aquaculture en raison de son temps de génération court, de sa facilité d’élevage et de son adaptabilité à un large éventail d’environnements d’élevage. L’intestin est d’un grand intérêt pour la recherche car c’est l’organe de la digestion et de l’absorption de la nutrition, du métabolisme et de l’immunité muqueuse. L’intestin est l’habitat des populations microbiennes et constitue un tissu immunitaire essentiel36. Il est immunologiquement actif en raison de la présence de nombreux types de cellules immunitaires, y compris les macrophages, les cellules B, les granulocytes et les cellules T.

Dans la présente étude, nous avons développé un protocole pour préparer une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil afin de faciliter les études au niveau unicellulaire chez les espèces de poissons d’aquaculture. Selon les caractéristiques de ces enzymes spécifiques aux tissus et les travaux préliminaires, la collagénase / dispase est appropriée pour dissocier le tissu intestinal du tilapia. Le dernier type d’enzyme à considérer dans la préparation de suspensions unicellulaires est la DNase-I, qui empêche l’agrégation cellulaire en dégradant l’ADN libre libéré par lyse des cellules mortes pendant la digestion enzymatique sans initier de voies apoptotiques9 et augmente le rendement en cellules vivantes36. De plus, de l’albumine sérique bovine (BSA) est ajoutée au tampon de lavage pour réduire l’agglutination cellulaire et améliorer la viabilité cellulaire. Plusieurs sociétés de réactifs décrivent BSA comme un stabilisateur enzymatique. L’ajout de BSA à 0,04%-1% au PBS (solution saline tamponnée au phosphate) a été utilisé pour développer une solution de lavage permettant de préparer des suspensions de séquençage unicellulaire sans effets indésirables38. L’ajout d’un faible ratio de BSA pourrait aider à maintenir la viabilité cellulaire et à éviter l’agrégation libre induite par l’ADN des cellules due à la lyse cellulaire. Ce protocole peut également fournir une référence précieuse pour le développement de protocoles de dissociation cellulaire des intestins d’autres espèces de poissons d’aquaculture.

Protocol

Tous les protocoles sur les animaux au cours de cette étude ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Hainan (numéro de protocole : HNUAUCC-2022-00063; Date d’approbation : 2022-03-03). Une liste de l’équipement et des fournitures utilisés dans cette expérience se trouve dans le tableau des matériaux. Un résumé du protocole actuel est illustré à la figure 1. …

Representative Results

Ce protocole décrit la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil pour le séquençage unicellulaire (Figure 1). Cette recherche montre que le mélange collagénase/dispase a un bon effet de dissociation et est doux pour les tissus intestinaux. La sélection de l’enzyme de digestion optimale est essentielle pour préparer une suspension unicellulaire de haute qualité. Dans les travaux préliminaires, les efficacités de dissociation …

Discussion

Ce protocole décrit la préparation d’une suspension unicellulaire de haute qualité de l’intestin du tilapia du Nil. Avant la dissociation, l’élimination de la graisse et du mésentère de l’intestin est nécessaire, en particulier pour les intestins de poisson carnivores avec beaucoup de graisse. L’utilisation d’une seringue au lieu d’un grattage dur pour laver le contenu intestinal réduit les dommages mécaniques aux cellules. Pour assurer la viabilité cellulaire, il est également essentiel de maint…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs souhaitent remercier la Fondation provinciale des sciences naturelles de Hainan de Chine (NO. 320QN211) et le programme de fonds de recherche du Laboratoire clé du Guangdong pour le contrôle des maladies des animaux aquatiques et la culture saine de Chine (NO. PBEA2021ZD01).

Materials

0.22-μm Sterile Filter Solarbio Life Sciences SLGV033RB It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer Solarbio Life Sciences F8200 Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich SRE0098 Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C.
Collagenase II Sangon Biotech A004202 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase Roche 10269638-001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase Sigma-Aldrich D4818 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I Sigma-Aldrich AMPD1 DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free Solarbio Life Sciences E607009-0500 Store at room temperature.
Elastase Sangon Biotech A600438 Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope Leica qTOWER3G It is used to examine cell viability.
Liberase Roche 5401119001 Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. NA Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS) Solarbio Life Sciences P1020 Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5424 It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor NEB M0314L Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent Sangon Biotech B644201-0050 It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521 For fish euthanasia. 
Trypan Blue Invitrogen C0040 It is used for staining dead cells.
Trypsin Sangon Biotech E607001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
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Wang, P., Zhou, Y., Wang, B., Elaswad, A., Wang, S., Guo, W., Zhang, D. Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (192), e64688, doi:10.3791/64688 (2023).
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