JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Single-Cell Suspension Voorbereiding van Nile Tilapia Intestine voor Single-Cell Sequencing

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64688
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea,Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery,Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science,Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine,Suez Canal University

Summary

Hier demonstreren we de voorbereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van tilapia-darm voor single-cell sequencing.

Abstract

Nijltilapia is een van de meest gekweekte zoetwatervissoorten wereldwijd en is een veelgebruikt onderzoeksmodel voor aquacultuurvisstudies. De bereiding van hoogwaardige eencellige suspensies is essentieel voor studies op single-cell niveau, zoals single-cell RNA of genome sequencing. Er is echter geen kant-en-klaar protocol voor aquacultuurvissoorten, met name voor de darm van tilapia. De effectieve dissociatie-enzymen variëren afhankelijk van het weefseltype. Daarom is het optimaliseren van het weefseldissociatieprotocol door de juiste enzym- of enzymcombinatie te selecteren om voldoende levensvatbare cellen met minimale schade te verkrijgen, essentieel. Deze studie illustreert een geoptimaliseerd protocol om een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nile tilapia-darm te bereiden met een enzymcombinatie van collagenase / dispase. Deze combinatie is zeer effectief voor dissociatie met het gebruik van runderserumalbumine en DNase om celaggregatie na de spijsvertering te verminderen. De celoutput voldoet aan de vereisten voor single-cell sequencing, met 90% cel levensvatbaarheid en een hoge celconcentratie. Dit protocol kan ook worden aangepast om een eencellige suspensie uit de darmen van andere vissoorten te bereiden. Dit onderzoek biedt een efficiënt referentieprotocol en vermindert de behoefte aan aanvullende proeven bij de bereiding van eencellige suspensies voor aquacultuurvissoorten.

Introduction

Cellen zijn de fundamentele eenheden van organismen. In vergelijking met bulkweefselstudies kunnen studies op eencellig niveau de heterogeniteit van cellen weerspiegelen en informatie met een hogere resolutie opleveren1. In de afgelopen jaren hebben onderzoekers single-cell sequencing-technologieën toegepast voor genoom-, transcriptoom-, epigenoom- of multi-omic-studies op eencellig niveau bij zoogdieren, zebravissen en andere modelorganismen en rapporteerden grote doorbraken 2,3,4,5,6,7 . Hoewel de meeste studies zich hebben gericht op modelorganismen, zijn er weinig referentieprotocollen of commerciële dissociatiekits voor single-cell sequencing in economische vissoorten, wat de toepassing van single-cell sequencing in aquacultuuronderzoek beperkt. Daarom is het ontwikkelen van weefseldissociatieprotocollen die hoogwaardige eencellige suspensies produceren met een hoge levensvatbaarheid van cellen en nucleïnezuurintegriteit cruciaal.

Het optimaliseren van het weefseldissociatieprotocol met de juiste enzym- of enzymcombinatie om voldoende levensvatbare cellen met minimale schade te verkrijgen, is essentieel. Het meest effectieve enzym voor weefseldissociatie varieert afhankelijk van het weefseltype. Bij zoogdieren zijn verschillende enzymen gebruikt om eencellige suspensies te bereiden voor vaste weefsels van zoogdieren, waaronder collagenase, dispase, trypsine, papaïne, elastase, hyaluronidase, liberase, accutase en trypLE 8,9. Trypsinevertering in combinatie met mechanische verstoring is vaak gebruikt om weefsels te dissociëren voor celkweek in vissen 10,11,12,13,14. Trypsine is ook gebruikt of toegevoegd aan de verteringscocktail voor weefseldissociatie in de rattendarm15 en zebraviskieuwweefsel16. Om verschillende redenen is trypsine echter niet de beste optie voor single-cell sequencing. Trypsine alleen is meestal niet effectief voor weefseldissociatie. Bovendien induceert trypsine DNA-strengbreuken 17,18 en RNA-afbraak19.

Papaïne breekt de eiwitten af die de tight junctions tussen cellen vormen. In zenuw- en gladde spiercellen van zoogdieren is papaïne efficiënter en minder destructief dan andere proteasen20,21. Net als trypsine resulteert papaïne echter in de vrije DNA-geïnduceerde aggregatie van cellen als gevolg van de cellysis die optreedt tijdens enzymatische spijsvertering9. Elastase breekt elastine af, dat meestal wordt aangetroffen in de huid, longen, ligamenten, pezen en vasculaire weefsels22. Het wordt vaak gebruikt in combinatie met collagenase, dispase of trypsine voor het dissociëren van longweefsel8. Hyaluronidase splitst de glycosidische bindingen van hyaluronaat en draagt bij aan de vertering van de extracellulaire matrix in verschillende bindweefsels en huid 9,23.

Over het algemeen zijn collagenase en dispase goede opties voor extracellulaire matrixafbraak. Ze zijn gebruikt bij de dissociatie van menselijke, muis- en zebravisdarmen24,25,26,27. Collagenase vernietigt de peptidebinding in collageen, bevordert de vertering van de extracellulaire matrix en geeft de cellen vrij in suspensie, en dus wordt collagenase vaak gebruikt voor dissociatie van vast weefsel van mens en muis, inclusief voor de lever 28,29, milt30, pancreas31 en darm 25. Dispase is een protease dat de N-terminale peptidebindingen van niet-polaire aminozuurresiduen hydrolyseert en milder is dan collagenase. Het splitst de extracellulaire matrixcomponenten, zoals fibronectine, type IV-collageen en in mindere mate type I-collageen, zonder cel-celverbindingen te beïnvloeden. Dispase wordt afzonderlijk of met andere enzymen gebruikt voor weefseldissociatie, zoals voor darm25,32, hersenen33, lever 34, enz. Bovendien zijn in de handel verkrijgbare digestiecocktails, waaronder liberase, accutase en trypLE, ook goede alternatieven voor dissociatie van vast weefsel, vooral voor de huid, lever en nieren 8,9.

Nijltilapia (Oreochromis niloticus) behoort tot de familie Cichlidae van de orde Perciformes. Het is een van de meest gekweekte zoetwatervissoorten in tropische en subtropische gebieden, met een jaarlijkse productie van 4,5 miljoen ton in 202235. Het is een van de best bestudeerde aquacultuurvissoorten met een goed geannoteerd genoom. Nijltilapia is een ideaal onderzoeksmodel voor aquacultuurvissoorten vanwege de korte generatietijd, het gemak van kweken en het aanpassingsvermogen aan een breed scala aan kweekomgevingen. De darm is van groot onderzoeksbelang omdat het het orgaan is van voedingsvertering en -absorptie, metabolisme en mucosale immuniteit. De darm is de habitat van microbiële populaties en is een essentieel immuunweefsel36. Het is immunologisch actief vanwege de aanwezigheid van talrijke immuunceltypen, waaronder macrofagen, B-cellen, granulocyten en T-cellen.

In de huidige studie hebben we een protocol ontwikkeld voor het bereiden van een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nijltilapia-darm om studies op eencellig niveau in aquacultuurvissoorten te vergemakkelijken. Volgens de kenmerken van deze weefselspecifieke enzymen en voorwerk is collagenase/dispase geschikt voor het dissociëren van tilapia-darmweefsel. Het laatste enzymtype waarmee rekening moet worden gehouden bij het bereiden van eencellige suspensies is DNase-I, dat celaggregatie voorkomt door vrij DNA af te breken dat vrijkomt door dode cellyse tijdens enzymatische spijsvertering zonder apoptotische routes te initiëren9 en verhoogt de levende celopbrengst36. Bovendien wordt runderserumalbumine (BSA) aan de wasbuffer toegevoegd om celklontering te verminderen en de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren. Verschillende reagensbedrijven beschrijven BSA als een enzymstabilisator. De toevoeging van 0,04%-1% BSA aan PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing) is gebruikt om een wasoplossing te ontwikkelen voor het bereiden van eencellige sequencing-suspensies zonder nadelige effecten38. De toevoeging van een lage verhouding BSA kan helpen de levensvatbaarheid van cellen te behouden en de vrije DNA-geïnduceerde aggregatie van cellen als gevolg van cellyse te voorkomen. Dit protocol kan ook een waardevolle referentie zijn voor het ontwikkelen van celdissociatieprotocollen uit de darmen van andere aquacultuurvissoorten.

Protocol

Alle dierprotocollen tijdens deze studie zijn goedgekeurd door de Hainan University Institutional Animal Care and Use Committee (protocolnummer: HNUAUCC-2022-00063; Goedkeuringsdatum: 2022-03-03). Een lijst van de apparatuur en benodigdheden die in dit experiment zijn gebruikt, is te vinden in de Materiaaltabel. Een samenvatting van het huidige protocol is weergegeven in figuur 1. 1. Visbereiding Verkrijg 6 maanden oude …

Representative Results

Dit protocol beschrijft de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van de Nijltilapia-darm voor eencellige sequencing (figuur 1). Uit dit onderzoek blijkt dat de collagenase/dispase mix een goed dissociatie effect heeft en mild is voor darmweefsel. De selectie van het optimale verteringsenzym is essentieel voor het bereiden van een hoogwaardige eencellige suspensie. In het voorbereidende werk werden de dissociatie-efficiënties van verschillende veelgebruikte enzymen vergeleken e…

Discussion

Dit protocol beschrijft de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van de nile tilapia darm. Vóór dissociatie is de verwijdering van vet en mesenterium uit de darm noodzakelijk, vooral voor vleesetende visdarmen met veel vet. Het gebruik van een spuit in plaats van hard schrapen om de darminhoud af te wassen, vermindert de mechanische schade aan de cellen. Om de levensvatbaarheid van de cellen te garanderen, is het ook essentieel om de temperatuur op 20 °C of lager te houden voor de weefseldissectie- en sp…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen de steun erkennen van de Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) en het Research Fund Program van Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).

Materials

0.22-μm Sterile Filter Solarbio Life Sciences SLGV033RB It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer Solarbio Life Sciences F8200 Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich SRE0098 Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C.
Collagenase II Sangon Biotech A004202 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase Roche 10269638-001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase Sigma-Aldrich D4818 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I Sigma-Aldrich AMPD1 DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free Solarbio Life Sciences E607009-0500 Store at room temperature.
Elastase Sangon Biotech A600438 Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope Leica qTOWER3G It is used to examine cell viability.
Liberase Roche 5401119001 Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. NA Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS) Solarbio Life Sciences P1020 Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5424 It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor NEB M0314L Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent Sangon Biotech B644201-0050 It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521 For fish euthanasia. 
Trypan Blue Invitrogen C0040 It is used for staining dead cells.
Trypsin Sangon Biotech E607001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
  2. He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
  3. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
  4. Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
  5. Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
  6. Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
  7. Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
  9. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
  10. Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
  11. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  12. Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
  13. Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
  14. Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
  15. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  16. Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
  17. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
  18. Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
  19. Vrtačnik, P., Kos, &. #. 3. 5. 2. ;., Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
  20. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  21. Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn’s colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
  22. Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
  23. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
  24. Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
  25. Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
  26. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
  27. Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
  28. Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
  29. Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
  30. Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
  31. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  32. Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  33. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
  34. Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
  35. FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , (2022).
  36. Beck, B. H., Peatman, E. . Mucosal Health in Aquaculture. , (2015).
  37. Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
  38. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
  39. Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
  40. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  41. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  42. Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
  43. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).

Tags

Single-cell SuspensionNile TilapiaIntestineSingle-cell SequencingEnzymatic Cell DissociationCollagenase DispasePBSFBSIntestinal ContentsMucusBSA-DPBSRNA InhibitorCell Strainer
check_url/64688?article_type=t&slug=single-cell-suspension-preparation-from-nile-tilapia-intestine-for

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, P., Zhou, Y., Wang, B., Elaswad, A., Wang, S., Guo, W., Zhang, D. Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (192), e64688, doi:10.3791/64688 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image