Hier demonstreren we de voorbereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van tilapia-darm voor single-cell sequencing.
Nijltilapia is een van de meest gekweekte zoetwatervissoorten wereldwijd en is een veelgebruikt onderzoeksmodel voor aquacultuurvisstudies. De bereiding van hoogwaardige eencellige suspensies is essentieel voor studies op single-cell niveau, zoals single-cell RNA of genome sequencing. Er is echter geen kant-en-klaar protocol voor aquacultuurvissoorten, met name voor de darm van tilapia. De effectieve dissociatie-enzymen variëren afhankelijk van het weefseltype. Daarom is het optimaliseren van het weefseldissociatieprotocol door de juiste enzym- of enzymcombinatie te selecteren om voldoende levensvatbare cellen met minimale schade te verkrijgen, essentieel. Deze studie illustreert een geoptimaliseerd protocol om een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nile tilapia-darm te bereiden met een enzymcombinatie van collagenase / dispase. Deze combinatie is zeer effectief voor dissociatie met het gebruik van runderserumalbumine en DNase om celaggregatie na de spijsvertering te verminderen. De celoutput voldoet aan de vereisten voor single-cell sequencing, met 90% cel levensvatbaarheid en een hoge celconcentratie. Dit protocol kan ook worden aangepast om een eencellige suspensie uit de darmen van andere vissoorten te bereiden. Dit onderzoek biedt een efficiënt referentieprotocol en vermindert de behoefte aan aanvullende proeven bij de bereiding van eencellige suspensies voor aquacultuurvissoorten.
Cellen zijn de fundamentele eenheden van organismen. In vergelijking met bulkweefselstudies kunnen studies op eencellig niveau de heterogeniteit van cellen weerspiegelen en informatie met een hogere resolutie opleveren1. In de afgelopen jaren hebben onderzoekers single-cell sequencing-technologieën toegepast voor genoom-, transcriptoom-, epigenoom- of multi-omic-studies op eencellig niveau bij zoogdieren, zebravissen en andere modelorganismen en rapporteerden grote doorbraken 2,3,4,5,6,7 . Hoewel de meeste studies zich hebben gericht op modelorganismen, zijn er weinig referentieprotocollen of commerciële dissociatiekits voor single-cell sequencing in economische vissoorten, wat de toepassing van single-cell sequencing in aquacultuuronderzoek beperkt. Daarom is het ontwikkelen van weefseldissociatieprotocollen die hoogwaardige eencellige suspensies produceren met een hoge levensvatbaarheid van cellen en nucleïnezuurintegriteit cruciaal.
Het optimaliseren van het weefseldissociatieprotocol met de juiste enzym- of enzymcombinatie om voldoende levensvatbare cellen met minimale schade te verkrijgen, is essentieel. Het meest effectieve enzym voor weefseldissociatie varieert afhankelijk van het weefseltype. Bij zoogdieren zijn verschillende enzymen gebruikt om eencellige suspensies te bereiden voor vaste weefsels van zoogdieren, waaronder collagenase, dispase, trypsine, papaïne, elastase, hyaluronidase, liberase, accutase en trypLE 8,9. Trypsinevertering in combinatie met mechanische verstoring is vaak gebruikt om weefsels te dissociëren voor celkweek in vissen 10,11,12,13,14. Trypsine is ook gebruikt of toegevoegd aan de verteringscocktail voor weefseldissociatie in de rattendarm15 en zebraviskieuwweefsel16. Om verschillende redenen is trypsine echter niet de beste optie voor single-cell sequencing. Trypsine alleen is meestal niet effectief voor weefseldissociatie. Bovendien induceert trypsine DNA-strengbreuken 17,18 en RNA-afbraak19.
Papaïne breekt de eiwitten af die de tight junctions tussen cellen vormen. In zenuw- en gladde spiercellen van zoogdieren is papaïne efficiënter en minder destructief dan andere proteasen20,21. Net als trypsine resulteert papaïne echter in de vrije DNA-geïnduceerde aggregatie van cellen als gevolg van de cellysis die optreedt tijdens enzymatische spijsvertering9. Elastase breekt elastine af, dat meestal wordt aangetroffen in de huid, longen, ligamenten, pezen en vasculaire weefsels22. Het wordt vaak gebruikt in combinatie met collagenase, dispase of trypsine voor het dissociëren van longweefsel8. Hyaluronidase splitst de glycosidische bindingen van hyaluronaat en draagt bij aan de vertering van de extracellulaire matrix in verschillende bindweefsels en huid 9,23.
Over het algemeen zijn collagenase en dispase goede opties voor extracellulaire matrixafbraak. Ze zijn gebruikt bij de dissociatie van menselijke, muis- en zebravisdarmen24,25,26,27. Collagenase vernietigt de peptidebinding in collageen, bevordert de vertering van de extracellulaire matrix en geeft de cellen vrij in suspensie, en dus wordt collagenase vaak gebruikt voor dissociatie van vast weefsel van mens en muis, inclusief voor de lever 28,29, milt30, pancreas31 en darm 25. Dispase is een protease dat de N-terminale peptidebindingen van niet-polaire aminozuurresiduen hydrolyseert en milder is dan collagenase. Het splitst de extracellulaire matrixcomponenten, zoals fibronectine, type IV-collageen en in mindere mate type I-collageen, zonder cel-celverbindingen te beïnvloeden. Dispase wordt afzonderlijk of met andere enzymen gebruikt voor weefseldissociatie, zoals voor darm25,32, hersenen33, lever 34, enz. Bovendien zijn in de handel verkrijgbare digestiecocktails, waaronder liberase, accutase en trypLE, ook goede alternatieven voor dissociatie van vast weefsel, vooral voor de huid, lever en nieren 8,9.
Nijltilapia (Oreochromis niloticus) behoort tot de familie Cichlidae van de orde Perciformes. Het is een van de meest gekweekte zoetwatervissoorten in tropische en subtropische gebieden, met een jaarlijkse productie van 4,5 miljoen ton in 202235. Het is een van de best bestudeerde aquacultuurvissoorten met een goed geannoteerd genoom. Nijltilapia is een ideaal onderzoeksmodel voor aquacultuurvissoorten vanwege de korte generatietijd, het gemak van kweken en het aanpassingsvermogen aan een breed scala aan kweekomgevingen. De darm is van groot onderzoeksbelang omdat het het orgaan is van voedingsvertering en -absorptie, metabolisme en mucosale immuniteit. De darm is de habitat van microbiële populaties en is een essentieel immuunweefsel36. Het is immunologisch actief vanwege de aanwezigheid van talrijke immuunceltypen, waaronder macrofagen, B-cellen, granulocyten en T-cellen.
In de huidige studie hebben we een protocol ontwikkeld voor het bereiden van een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nijltilapia-darm om studies op eencellig niveau in aquacultuurvissoorten te vergemakkelijken. Volgens de kenmerken van deze weefselspecifieke enzymen en voorwerk is collagenase/dispase geschikt voor het dissociëren van tilapia-darmweefsel. Het laatste enzymtype waarmee rekening moet worden gehouden bij het bereiden van eencellige suspensies is DNase-I, dat celaggregatie voorkomt door vrij DNA af te breken dat vrijkomt door dode cellyse tijdens enzymatische spijsvertering zonder apoptotische routes te initiëren9 en verhoogt de levende celopbrengst36. Bovendien wordt runderserumalbumine (BSA) aan de wasbuffer toegevoegd om celklontering te verminderen en de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren. Verschillende reagensbedrijven beschrijven BSA als een enzymstabilisator. De toevoeging van 0,04%-1% BSA aan PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing) is gebruikt om een wasoplossing te ontwikkelen voor het bereiden van eencellige sequencing-suspensies zonder nadelige effecten38. De toevoeging van een lage verhouding BSA kan helpen de levensvatbaarheid van cellen te behouden en de vrije DNA-geïnduceerde aggregatie van cellen als gevolg van cellyse te voorkomen. Dit protocol kan ook een waardevolle referentie zijn voor het ontwikkelen van celdissociatieprotocollen uit de darmen van andere aquacultuurvissoorten.
Dit protocol beschrijft de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van de nile tilapia darm. Vóór dissociatie is de verwijdering van vet en mesenterium uit de darm noodzakelijk, vooral voor vleesetende visdarmen met veel vet. Het gebruik van een spuit in plaats van hard schrapen om de darminhoud af te wassen, vermindert de mechanische schade aan de cellen. Om de levensvatbaarheid van de cellen te garanderen, is het ook essentieel om de temperatuur op 20 °C of lager te houden voor de weefseldissectie- en sp…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen de steun erkennen van de Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) en het Research Fund Program van Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).
0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C. |
Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |