सिंगल-सेल सीक्वेंसिंग के लिए नाइल तिलापिया आंत से सिंगल-सेल सस्पेंशन तैयारी
Summary
यहां, हम एकल-कोशिका अनुक्रमण के लिए तिलापिया आंत के उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी का प्रदर्शन करते हैं।
Abstract
नील तिलापिया दुनिया भर में सबसे अधिक सुसंस्कृत मीठे पानी की मछली प्रजातियों में से एक है और जलीय कृषि मछली अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला शोध मॉडल है। एकल-कोशिका आरएनए या जीनोम अनुक्रमण जैसे एकल-कोशिका स्तर के अध्ययन के लिए उच्च-गुणवत्ता वाले एकल-सेल निलंबन की तैयारी आवश्यक है। हालांकि, जलीय कृषि मछली प्रजातियों के लिए कोई उपयोग के लिए तैयार प्रोटोकॉल नहीं है, विशेष रूप से तिलापिया की आंत के लिए। ऊतक प्रकार के आधार पर प्रभावी पृथक्करण एंजाइम भिन्न होते हैं। इसलिए, न्यूनतम क्षति के साथ पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त एंजाइम या एंजाइम संयोजन का चयन करके ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल का अनुकूलन आवश्यक है। यह अध्ययन नील तिलापिया आंत से एक उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन को तैयार करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल को दर्शाता है, जिसमें कोलेजनेस / डिस्पेस के एंजाइम संयोजन के साथ होता है। पाचन के बाद सेल एकत्रीकरण को कम करने के लिए गोजातीय सीरम एल्बुमिन और डीनेस के उपयोग के साथ पृथक्करण के लिए यह संयोजन अत्यधिक प्रभावी है। सेल आउटपुट 90% सेल व्यवहार्यता और उच्च सेल एकाग्रता के साथ एकल-सेल अनुक्रमण के लिए आवश्यकताओं को पूरा करता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य मछली प्रजातियों की आंतों से एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए भी संशोधित किया जा सकता है। यह शोध एक कुशल संदर्भ प्रोटोकॉल प्रदान करता है और जलीय कृषि मछली प्रजातियों के लिए एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी में अतिरिक्त परीक्षणों की आवश्यकता को कम करता है।
Introduction
कोशिकाएं जीवों की मूलभूत इकाइयाँ हैं। थोक-ऊतक अध्ययनों की तुलना में, एकल-कोशिका स्तर के अध्ययन सेल विषमता को प्रतिबिंबित कर सकते हैं और उच्च-रिज़ॉल्यूशनजानकारी प्रदान कर सकते हैं। हाल के वर्षों में, शोधकर्ताओं ने स्तनधारियों, ज़ेबराफिश और अन्य मॉडल जीवों में एकल-कोशिका स्तर पर जीनोम, ट्रांसक्रिपटम, एपिजेनोम, या मल्टी-ओमिक अध्ययनों के लिए एकल-कोशिका अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों को लागू किया है और 2,3,4,5,6,7 की बड़ी सफलताओं की सूचना दी है।. जबकि अधिकांश अध्ययनों ने मॉडल जीवों पर ध्यान केंद्रित किया है, आर्थिक मछली प्रजातियों में एकल-कोशिका अनुक्रमण के लिए कुछ संदर्भ प्रोटोकॉल या वाणिज्यिक पृथक्करण किट हैं, जो जलीय कृषि अनुसंधान में एकल-कोशिका अनुक्रमण के आवेदन को सीमित करता है। इसलिए, ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल विकसित करना जो उच्च सेल व्यवहार्यता और न्यूक्लिक एसिड अखंडता के साथ उच्च गुणवत्ता वाले एकल-सेल निलंबन का उत्पादन करता है, महत्वपूर्ण है।
न्यूनतम क्षति के साथ पर्याप्त व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त एंजाइम या एंजाइम संयोजन के साथ ऊतक पृथक्करण प्रोटोकॉल का अनुकूलन आवश्यक है। ऊतक पृथक्करण के लिए सबसे प्रभावी एंजाइम ऊतक प्रकार के आधार पर भिन्न होता है। स्तनधारियों में, स्तनधारी ठोस ऊतकों के लिए एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए कई एंजाइमों का उपयोग किया गया है, जिसमें कोलेजनेज़, डिस्पास, ट्रिप्सिन, पपैन, इलास्टेस, हाइलूरोनिडेज़, लिबरेज, एक्यूटेज़ और ट्राइप्ले 8,9 शामिल हैं। यांत्रिक व्यवधान के साथ संयुक्त ट्रिप्सिन पाचन का उपयोग आमतौर पर मछली10,11,12,13,14 में सेल कल्चर के लिए ऊतकों को अलग करने के लिए किया जाता है। ट्रिप्सिन का उपयोग चूहे की आंत15 और ज़ेब्राफिश गिल ऊतक16 में ऊतक पृथक्करण के लिए पाचन कॉकटेल में भी किया गया है। हालांकि, कई कारणों से, ट्रिप्सिन एकल-कोशिका अनुक्रमण के लिए सबसे अच्छा विकल्प नहीं है। अकेले ट्रिप्सिन आमतौर पर ऊतक पृथक्करण के लिए अप्रभावी होता है। इसके अतिरिक्त, ट्रिप्सिन डीएनए स्ट्रैंडको 17,18 और आरएनए गिरावट 19 को प्रेरित करता है।
पपैन प्रोटीन को नीचा दिखाता है जो कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शन बनाते हैं। स्तनधारी तंत्रिका और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में, पपैन अन्य प्रोटीज20,21 की तुलना में अधिक कुशल और कम विनाशकारी है। हालांकि, ट्रिप्सिन की तरह, पपैन के परिणामस्वरूप सेल लाइसिस के कारण कोशिकाओं के मुक्त डीएनए-प्रेरित एकत्रीकरण होता है जो एंजाइमेटिक पाचन9 के दौरान होता है। इलास्टेस इलास्टिन को तोड़ता है, जो आमतौर पर त्वचा, फेफड़े, स्नायुबंधन, टेंडन और संवहनी ऊतकों में पाया जाताहै। यह अक्सर फेफड़ोंके ऊतकों को अलग करने के लिए कोलेजनेज, डिस्पेस, या ट्रिप्सिन के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है। Hyaluronidase Hyaluronan के ग्लाइकोसिडिक बॉन्ड को छोड़ देता है, जो विभिन्न संयोजी ऊतकों और त्वचा में बाह्य मैट्रिक्स के पाचन में योगदान देता है 9,23.
सामान्य तौर पर, कोलेजनेज और डिस्पेस बाह्य मैट्रिक्स टूटने के लिए अच्छे विकल्प हैं। उनका उपयोग मानव, माउस और जेब्राफिश आंतों 24,25,26,27 के पृथक्करण में किया गया है। कोलेजनेस कोलेजन में पेप्टाइड बंधन को नष्ट कर देता है, बाह्य मैट्रिक्स के पाचन को बढ़ावा देता है, और कोशिकाओं को निलंबन में छोड़ देता है, और, इस प्रकार, कोलेजनेज का उपयोग अक्सर मानव और माउस ठोस ऊतक पृथक्करण के लिए किया जाता है, जिसमें यकृत28,29, प्लीहा30, अग्न्याशय31 और आंत 25 शामिल हैं।. डिस्पेस एक प्रोटीज है जो नॉनपोलर अमीनो एसिड अवशेषों के एन-टर्मिनल पेप्टाइड बॉन्ड को हाइड्रोलाइज करता है और कोलेजनेस की तुलना में हल्का है। यह सेल-सेल जंक्शनों को प्रभावित किए बिना फाइब्रोनेक्टिन, टाइप IV कोलेजन, और कुछ हद तक, टाइप 1 कोलेजन जैसे बाह्य मैट्रिक्स घटकों को छोड़ देता है। डिस्पेस का उपयोग ऊतक पृथक्करण के लिए अलग से या अन्य एंजाइमों के साथ किया जाता है, जैसे कि आंत25,32, मस्तिष्क33, यकृत34, आदि। इसके अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पाचन कॉकटेल, जिसमें लिबरेज, एक्यूटेस और ट्राइप्ले शामिल हैं, ठोस ऊतक पृथक्करण के लिए भी अच्छे विकल्प हैं, खासकर त्वचा, यकृतऔर गुर्दे 8,9 के लिए।
नाइल तिलापिया (ओरियोक्रोमिस निलोटिकस) पर्सिफोर्म्स क्रम के सिक्लिडे परिवार से संबंधित है। यह उष्णकटिबंधीय और उपोष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में सबसे सुसंस्कृत मीठे पानी की मछली प्रजातियों में से एक है, जिसका वार्षिक उत्पादन 202235 में 4.5 मिलियन टन है। यह एक अच्छी तरह से एनोटेट जीनोम के साथ सबसे अच्छी तरह से अध्ययन की गई जलीय कृषि मछली प्रजातियों में से एक है। नील तिलापिया अपनी छोटी पीढ़ी के समय, पालन में आसानी और पालन वातावरण की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलनशीलता के कारण जलीय कृषि मछली प्रजातियों के लिए एक आदर्श अनुसंधान मॉडल है। आंत बहुत शोध रुचि का है क्योंकि यह पोषण, पाचन और अवशोषण, चयापचय और श्लैष्मिक प्रतिरक्षा का अंग है। आंत माइक्रोबियल आबादी का निवास स्थान है और एक आवश्यक प्रतिरक्षा ऊतकहै। मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं, ग्रैनुलोसाइट्स और टी कोशिकाओं सहित कई प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों की उपस्थिति के कारण यह प्रतिरक्षात्मक रूप से सक्रिय है।
वर्तमान अध्ययन में, हमने जलीय कृषि मछली प्रजातियों में एकल-कोशिका स्तर के अध्ययन की सुविधा के लिए नील तिलापिया आंत से उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया। इन ऊतक-विशिष्ट एंजाइमों और प्रारंभिक कार्य की विशेषताओं के अनुसार, तिलपिया आंत ऊतक को अलग करने के लिए कोलेजनेज / डिस्पेस उपयुक्त है। एकल-कोशिका निलंबन तैयार करने में विचार करने के लिए अंतिम एंजाइम प्रकार DNase-I है, जो एपोप्टोटिक मार्ग9 शुरू किए बिना एंजाइमेटिक पाचन के दौरान मृत सेल लाइसिस के माध्यम से जारी मुक्त डीएनए को कम करके सेल एकत्रीकरण को रोकता है और जीवित सेल उपज36 को बढ़ाता है। इसके अतिरिक्त, सेल क्लंपिंग को कम करने और सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) को वॉशिंग बफर में जोड़ा जाता है। कई अभिकर्मक कंपनियां बीएसए को एंजाइम स्टेबलाइजर के रूप में वर्णित करती हैं। पीबीएस (फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन) में 0.04% -1% बीएसए को जोड़ने का उपयोगप्रतिकूल प्रभावों के बिना एकल-सेल अनुक्रमण निलंबन तैयार करने के लिए एक वाशिंग समाधान विकसित करने के लिए किया गया है। बीएसए के कम अनुपात को जोड़ने से सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने और सेल लाइसिस के कारण कोशिकाओं के मुक्त डीएनए-प्रेरित एकत्रीकरण से बचने में मदद मिल सकती है। यह प्रोटोकॉल अन्य जलीय कृषि मछली प्रजातियों की आंतों से सेल पृथक्करण प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए एक मूल्यवान संदर्भ भी प्रदान कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल नील तिलापिया आंत के उच्च गुणवत्ता वाले एकल-कोशिका निलंबन की तैयारी का वर्णन करता है। पृथक्करण से पहले, आंत से वसा और मेसेंटरी को हटाना आवश्यक है, खासकर मांसाहारी मछली की आंतों के लिए बहुत व…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक चीन के हैनान प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (संख्या 320क्यूएन 211) और चीन के जलीय पशु रोग नियंत्रण और स्वस्थ संस्कृति के गुआंग्डोंग प्रांतीय कुंजी प्रयोगशाला के अनुसंधान निधि कार्यक्रम (NO. PBEA2021ZD01) से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
| 40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C. |
| Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
| DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
| Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
| Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
| Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
| Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
| Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
| RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
| Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
| Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
| Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
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