Una plataforma microfluídica para estudiar la bioobstrucción en medios porosos
Summary
El presente protocolo describe una plataforma microfluídica para estudiar el desarrollo de biopelículas en medios porosos cuasi-2D mediante la combinación de imágenes de microscopía de alta resolución con mediciones simultáneas de diferencia de presión. La plataforma cuantifica la influencia del tamaño de poro y las tasas de flujo de fluidos en medios porosos en la bioobstrucción.
Abstract
Las biopelículas bacterianas se encuentran en varios medios porosos ambientales e industriales, incluidos los suelos y las membranas de filtración. Las biopelículas crecen bajo ciertas condiciones de flujo y pueden obstruir los poros, redirigiendo así el flujo de fluido local. La capacidad de las biopelículas para obstruir los poros, la llamada bioobstrucción, puede tener un efecto tremendo en la permeabilidad local del medio poroso, creando una acumulación de presión en el sistema e impactando el flujo másico a través de él. Para comprender la interacción entre el crecimiento de la biopelícula y el flujo de fluidos en diferentes condiciones físicas (por ejemplo, a diferentes velocidades de flujo y tamaños de poro), en el presente estudio, se desarrolla una plataforma microfluídica para visualizar el desarrollo de la biopelícula utilizando un microscopio bajo condiciones físicas controladas e impuestas externamente. La acumulación de presión inducida por la biopelícula en el medio poroso se puede medir simultáneamente utilizando sensores de presión y, más tarde, correlacionarse con la cobertura superficial de la biopelícula. La plataforma presentada proporciona una línea de base para un enfoque sistemático para investigar la bioobstrucción causada por biopelículas en medios porosos en condiciones de flujo y se puede adaptar para estudiar aislados ambientales o biopelículas multiespecies.
Introduction
Las biopelículas (colonias bacterianas incrustadas en una matriz autosecretada de sustancias extrapoliméricas (EPS), son ubicuas en medios porosos naturales, como suelos y acuíferos1, y aplicaciones técnicas y médicas, como biorremediación2, filtración de agua3 y dispositivos médicos4. La matriz de biofilm está compuesta por polisacáridos, fibras proteicas y ADN extracelular5,6, y depende fuertemente de los microorganismos, la disponibilidad de nutrientes, así como las condiciones ambientales7. Sin embargo, las funciones de la matriz son universales; Forma el andamio de la estructura del biofilm, protege a la comunidad microbiana de tensiones mecánicas y químicas, y es en gran parte responsable de las propiedades reológicas de los biofilms5.
En medios porosos, el crecimiento de biopelículas puede obstruir los poros, causando la llamada bioobstrucción. El desarrollo del biofilm está controlado por el flujo de fluido y el tamaño de poro, definido como la distancia que separa dos pilares, del medio poroso 8,9,10. Tanto el tamaño de poro como el flujo de fluido controlan el transporte de nutrientes y las fuerzas de cizallamiento locales. A su vez, el biofilm creciente obstruye los poros, afectando la distribución de la velocidad del fluido 11,12,13, el transporte de masa y la conductividad hidráulica del medio poroso 14,15. Los cambios en la conductividad hidráulica se reflejan a través del aumento de la presión en sistemas confinados16,17,18,19. Los estudios microfluídicos actuales en el desarrollo de biopelículas y la bioobstrucción se centran en estudiar el impacto de las velocidades de flujo en geometrías homogéneas16,20 (es decir, con un tamaño de poro singular) o medios porosos heterogéneos12,21,22. Sin embargo, para desentrañar los efectos de las tasas de flujo y el tamaño de poro en el desarrollo de biopelículas y los cambios de presión resultantes en el medio poroso bioobstruido, se requiere una plataforma experimental altamente controlable y versátil que permita el estudio de diferentes geometrías de medios porosos y condiciones ambientales en paralelo.
El presente estudio introduce una plataforma microfluídica que combina mediciones de presión con imágenes simultáneas de la biopelícula en evolución dentro del medio poroso. Debido a su permeabilidad al gas, biocompatibilidad y flexibilidad en el diseño de la geometría del canal, un dispositivo microfluídico hecho de polidimetilsiloxano (PDMS) es una herramienta adecuada para estudiar el desarrollo de biopelículas en medios porosos. La microfluídica permite el control de las condiciones físicas y químicas (por ejemplo, flujo de fluidos y concentración de nutrientes) con alta precisión para imitar el ambiente de los hábitats microbianos23. Además, los dispositivos microfluídicos se pueden visualizar fácilmente con resolución micrométrica utilizando un microscopio óptico y junto con mediciones en línea (por ejemplo, la presión local).
En este trabajo, los experimentos se centran en estudiar el impacto del tamaño de poro en un análogo de medio poroso homogéneo bajo condiciones de flujo impuesto controladas. El flujo de un medio de cultivo se impone utilizando una bomba de jeringa, y la diferencia de presión a través del canal microfluídico se mide simultáneamente con sensores de presión. El desarrollo del biofilm se inicia mediante la siembra de un cultivo planctónico de Bacillus subtilis en el canal microfluídico. Las imágenes regulares de la biopelícula en evolución y el análisis de imágenes permiten obtener información resuelta a escala de poros en la cobertura de la superficie bajo diversas condiciones experimentales. La información correlacionada del cambio de presión y el grado de bioobstrucción proporciona información crucial para las estimaciones de permeabilidad de medios porosos bioobstruidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los análogos de medios porosos microfluídicos junto con sensores de presión proporcionan una herramienta adecuada para estudiar el desarrollo de biopelículas en medios porosos. La versatilidad en el diseño del medio poroso microfluídico, específicamente la disposición de los pilares, incluido el diámetro, las formas irregulares y el tamaño de poro, permite la investigación de muchas geometrías. Estas geometrías van desde poros individuales hasta obstáculos altamente complejos y dispuestos irregularmente que…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo de la subvención SNSF PRIMA 179834 (a E.S.), la financiación discrecional de ETH (a R.S.), ETH Zurich Research Grant (a R.S. y J.J.M.) y la financiación discrecional de Eawag (a J.J.M.). Los autores desean agradecer a Roberto Pioli por ilustrar la configuración experimental en la Figura 1B y a Ela Burmeister por la preparación de la oblea de silicio.
Materials
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane | Pall Corporation | PN4190 | 1.2 µm filters |
| BD 10 mL Syringe (Luer-Lock) | BD | 300912 | used to fill the channel with deionised water |
| Box Incubator | Life Imaging Services | used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment | |
| Cell density meter CO8000 | WPA biowave | OD meter | |
| Centrifuge vial | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL |
| CETONI Base 120 | CETONI GmbH | syringe pump | |
| CorelCAD | CorelDRAW | software used to design the microfluidic channel geometries | |
| Culture tubes (14 mL, sterile) | greiner bio-one | Culture tubes | |
| Drying oven, VENTI-Line | VWR | Oven to cure the PDMS | |
| Handy | Migros | Detergent solution | |
| Hot plate with temperature control | VRW | to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment | |
| ImageJ | FIJI | Image analysis software | |
| Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick) | Eppendorf | Incubator | |
| Isopropanol (> 99.8%) | Sigma Aldrich | 67-63-0 | |
| Masterflex transfer tubing | Masterflex | HV-06419-05 | 0.020'' ID, 0.06'' OD |
| Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm | Corning | 2947-75X50 | Glass slides |
| Microfluidic pressure sensor (1 bar) | Elveflow | Pressure sensors | |
| Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm | Integra | Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel | |
| mrDev600 developer | Microresist | ||
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon Instruments | Microscope | |
| Nutrient broth n°3 | Sigma Aldrich | ||
| Omnifix Syringe with Luer-Lock | B.Braun | syringes of different volume | |
| Plasma chamber Zepto | Diener Electronic | ZEPTO-1 | used to plasma bond the PDMS and the glass slide |
| Precision wipes (Kimtech Science) | Kimberly Clark | KCP-7552 | to dry the glass slide |
| Scale | VWR-CH | 611-2605 | used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio |
| Silicon wafer (10 cm) | Silicon Materials Inc. | N//Phos <100> 1-10 Ω cm | |
| Spincoater, Spin module SM150 | Sawatec | ||
| SU8 3050 Photoresist | Kayakuam | ||
| Süss MA6 Mask aligner | SUSS MicroTec Group | used to align the chrome-glass mask | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | silicone elastomer kit; curing agent | |
| Techni Etch Cr01 | Technic | Technic | |
| Tissue culture dish 150 | TPP | 93150 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane | Sigma Aldrich | Sigma Aldrich | used to silanize the silicane wafer |
| Veeco Dektak 6 M | Veeco | Profilometer |
Referências
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