Imagerie intravitale de l’expression de protéines fluorescentes chez des souris présentant un traumatisme crânien à crâne fermé et une fenêtre crânienne à l’aide d’un microscope à deux photons
Summary
Cette étude démontre l’administration d’un traumatisme crânien répétitif à des souris et l’implantation simultanée d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie intravitale ultérieure d’un EGFP exprimé par neurone à l’aide de la microscopie à deux photons.
Abstract
L’objectif de ce protocole est de démontrer comment visualiser longitudinalement l’expression et la localisation d’une protéine d’intérêt dans des types cellulaires spécifiques du cerveau d’un animal, lors d’une exposition à des stimuli exogènes. Ici, l’administration d’un traumatisme crânien (TCC) à crâne fermé et l’implantation simultanée d’une fenêtre crânienne pour une imagerie intravitale longitudinale ultérieure chez la souris sont montrées. Des souris sont injectées par voie intracrânienne avec un virus adéno-associé (AAV) exprimant une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous un promoteur neuronal spécifique. Après 2 à 4 semaines, les souris sont soumises à un traumatisme crânien répétitif à l’aide d’un dispositif de perte de poids au-dessus de l’emplacement d’injection de l’AAV. Au cours de la même séance chirurgicale, les souris sont implantées avec une tige de tête en métal, puis une fenêtre crânienne en verre sur le site d’impact du TCC. L’expression et la localisation cellulaire de l’EGFP sont examinées à l’aide d’un microscope à deux photons dans la même région du cerveau exposée à un traumatisme pendant des mois.
Introduction
Les traumatismes crâniens (TCC), qui peuvent résulter de blessures sportives, de collisions de véhicules et de combats militaires, sont un problème de santé mondial. Les traumatismes crâniens peuvent entraîner des déficits physiologiques, cognitifs et comportementaux, ainsi qu’une invalidité ou une mortalité à vie 1,2. La gravité des traumatismes crâniens peut être classée comme légère, modérée et sévère, la grande majorité étant un traumatisme crânien léger (75 % à 90 %)3. Il est de plus en plus reconnu que les traumatismes crâniens, en particulier les occurrences répétitives de traumatismes crâniens, peuvent favoriser la dégénérescence neuronale et servir de facteurs de risque pour plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer (MA), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la démence frontotemporale (DFT) et l’encéphalopathie traumatique chronique (ETC)4,5,6. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la neurodégénérescence induite par les TCC restent flous et représentent donc un domaine d’étude actif. Pour mieux comprendre comment les neurones réagissent et se rétablissent d’un traumatisme crânien, une méthode de surveillance des protéines d’intérêt marquées par fluorescence, en particulier dans les neurones, par imagerie intravitale longitudinale chez la souris après un traumatisme crânien est décrite ici.
À cette fin, cette étude montre comment combiner une intervention chirurgicale pour l’administration d’un traumatisme crânien fermé qui est similaire à ce qui a été rapporté précédemment7,8, avec une procédure chirurgicale pour l’implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie intravitale en aval, telle que décrite par Goldey et al9. Notamment, il n’est pas possible d’implanter d’abord une fenêtre crânienne et d’effectuer ensuite un TCC dans la même région, car l’impact de la perte de poids qui induit le TCC est susceptible d’endommager la fenêtre et de causer des dommages irréparables à la souris. Par conséquent, ce protocole a été conçu pour administrer le traumatisme crânien, puis implanter la fenêtre crânienne directement sur le site d’impact, le tout au cours de la même séance chirurgicale. L’un des avantages de combiner à la fois le traumatisme crânien et l’implantation de la fenêtre crânienne en une seule séance chirurgicale est la réduction du nombre de fois qu’une souris est soumise à une intervention chirurgicale. De plus, il permet de surveiller la réponse immédiate (c’est-à-dire sur une échelle de temps de quelques heures) à un traumatisme crânien, par opposition à l’implantation de la fenêtre lors d’une séance chirurgicale ultérieure (c’est-à-dire l’imagerie initiale commençant sur une échelle de temps de plusieurs jours après le traumatisme crânien). La fenêtre crânienne et la plateforme d’imagerie intravitale offrent également des avantages par rapport à la surveillance des protéines neuronales par des méthodes conventionnelles telles que l’immunomarquage des tissus fixés. Par exemple, moins de souris sont nécessaires pour l’imagerie intravitale, car la même souris peut être étudiée à plusieurs moments, par opposition à des cohortes distinctes de souris nécessaires pour des points temporels discrets. De plus, les mêmes neurones peuvent être surveillés au fil du temps, ce qui permet de suivre des événements biologiques ou pathologiques spécifiques au sein de la même cellule.
À titre de preuve de concept, l’expression neuronale spécifique de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous le promoteur de synapsine est démontrée ici10. Cette approche peut être étendue à 1) différents types de cellules cérébrales en utilisant d’autres promoteurs spécifiques au type cellulaire, tels que le promoteur de la protéine de base de la myéline (MBP) pour les oligodendrocytes et le promoteur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) pour les astrocytes,11, 2) différentes protéines cibles d’intérêt en fusionnant leurs gènes avec le gène EGFP, et 3) co-exprimant plusieurs protéines fusionnées à différents fluorophores. Ici, l’EGFP est conditionné et exprimé par l’administration d’un virus adéno-associé (AAV) par injection intracrânienne. Un traumatisme crânien fermé est administré à l’aide d’un dispositif de perte de poids, suivi de l’implantation d’une fenêtre crânienne. La visualisation de l’EGFP neuronal est réalisée à travers la fenêtre crânienne, en utilisant la microscopie à deux photons pour détecter la fluorescence de l’EGFP in vivo. Avec le laser à deux photons, il est possible de pénétrer plus profondément dans le tissu cortical avec un minimum de photodommages, ce qui permet une imagerie longitudinale répétée des mêmes régions corticales au sein d’une souris individuelle pendant des jours et jusqu’aux mois12,13,14,15. En somme, cette approche combinant une chirurgie de traumatisme crânien avec l’imagerie intravitale vise à faire progresser la compréhension des événements moléculaires qui contribuent à la pathologie de la maladie induite par le TCC16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, l’injection d’AAV, l’administration d’un TBI et un poste de tête avec implantation de fenêtre crânienne ont été combinés pour une analyse d’imagerie longitudinale des neurones marqués à l’EGFP dans le cortex cérébral de la souris (couches IV et V) afin d’observer les effets du TBI sur les neurones corticaux. Cette étude note que le site du TCC choisi ici, au-dessus de l’hippocampe, offre une surface relativement plane et large pour l’implantation de la fenêtre crânienne. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Miguel Sena-Esteves de la Chan Medical School de l’Université du Massachusetts pour avoir fait don du virus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, et Debra Cameron de la Chan Medical School de l’Université du Massachusetts pour avoir dessiné le croquis du crâne des souris. Nous remercions également les membres actuels et passés des laboratoires Bosco, Schafer et Henninger pour leurs suggestions et leur soutien. Ces travaux ont été financés par le Département de la Défense (W81XWH202071/PRARP) à DAB, DS et NH.
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
Referências
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