Summary
Her presenterer vi en ikke-genetisk metode for å generere humane autologe leversfæroider ved bruk av mononukleære celler isolert fra steady-state perifert blod.
Abstract
Menneskelige leverceller kan danne en tredimensjonal (3D) struktur som er i stand til å vokse i kultur i noen uker, og bevare deres funksjonelle kapasitet. På grunn av deres natur å klynge i kulturretter med lave eller ingen klebende egenskaper, danner de aggregater av flere leverceller som kalles humane leversfæroider. Dannelsen av 3D-leversfæroider er avhengig av den naturlige tendensen til leverceller til å aggregere i fravær av et klebende substrat. Disse 3D-strukturene har bedre fysiologiske responser enn celler, som er nærmere et in vivo-miljø . Bruk av 3D-hepatocyttkulturer har mange fordeler sammenlignet med klassiske todimensjonale (2D) kulturer, inkludert et mer biologisk relevant mikromiljø, arkitektonisk morfologi som setter sammen naturlige organer, samt en bedre prediksjon om sykdomstilstand og in vivo-lignende responser på legemidler. Ulike kilder kan brukes til å generere sfæroider, som primært levervev eller immortaliserte cellelinjer. 3D-levervevet kan også konstrueres ved å bruke humane embryonale stamceller (hESCs) eller induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) for å utlede hepatocytter. Vi har oppnådd humane leversfæroider ved bruk av blodavledede pluripotente stamceller (BD-PSCs) generert fra umanipulert perifert blod ved aktivering av humant membranbundet GPI-bundet protein og differensiert til humane hepatocytter. BD-PSCs-avledede humane leverceller og humane leversfæroider ble analysert ved lysmikroskopi og immunfenotyping ved bruk av humane hepatocyttmarkører.
Introduction
I de senere år har tredimensjonale (3D) sfæroidkultursystemer blitt et viktig verktøy for å studere ulike områder av kreftforskning, narkotikaforskning og toksikologi. Slike kulturer vekker stor interesse fordi de bygger bro over gapet mellom todimensjonale (2D) cellekulturmonolag og komplekse organer1.
I fravær av en klebende overflate, sammenlignet med 2D-cellekulturen, er dannelsen av sfæroider basert på den naturlige affiniteten til disse cellene til klynge i 3D-form. Disse cellene organiserer seg i grupper som består av en eller flere typer modne celler. Fri for fremmede materialer samhandler disse cellene med hverandre som i sitt opprinnelige mikromiljø. Cellene i 3D-kulturen er mye nærmere og har en riktig orientering mot hverandre, med høyere ekstracellulær matriksproduksjon enn 2D-kulturer, og utgjør et nært naturmiljø 2.
Dyremodeller har lenge vært brukt for å studere menneskelig biologi og sykdommer3. I denne forbindelse er det iboende forskjeller mellom mennesker og dyr, noe som gjør at disse modellene ikke er helt egnet for ekstrapolative studier. 3D-kultursfæroider og organoider representerer et lovende verktøy for å studere vevslignende arkitektur, interaksjon og krysstale mellom forskjellige celletyper som forekommer in vivo og kan bidra til å redusere eller til og med erstatte dyremodeller. De er av spesiell interesse for å studere patogenesen av leversykdommer samt narkotika screening plattformer4.
3D sfæroidkultur er spesielt viktig for kreftforskning, da det kan eliminere diskontinuiteten mellom cellene og deres miljø ved å redusere behovet for trypsinisering eller kollagenasebehandling som trengs for å forberede tumorcellemonolagene for 2D-kulturer. Tumorsfæroider gjør det mulig å studere hvordan normale versus ondartede celler mottar og reagerer på signaler fra omgivelsene5 og er en viktig del av tumorbiologiske studier.
Sammenlignet med monolaget ligner 3D-kulturer bestående av forskjellige celletyper tumorvev i deres strukturelle og funksjonelle egenskaper og er derfor egnet for å studere metastase og invasjon av tumorceller. Derfor bidrar slike sfæroide modeller til å akselerere kreftforskningen6.
Sfæroider bidrar også til å utvikle teknologien for å skape menneskelige organoider fordi vev og organbiologi er svært utfordrende å studere, spesielt hos mennesker. Fremgang i stamcellekultur gjør det mulig å utvikle 3D-kulturer som organoider bestående av stamceller og vevsforfedre samt forskjellige typer modne (vev) celler fra et organ med noen funksjonelle egenskaper som et ekte organ som kan brukes til å modellere organutvikling, sykdommer, men de kan også betraktes som nyttige i regenerativ medisin7.
Primære humane hepatocytter brukes vanligvis til å studere in vitro biologi av humane hepatocytter, leverfunksjon og legemiddelindusert toksisitet. Kulturer av humane hepatocytter har to hovedulemper, for det første den begrensede tilgjengeligheten av primærvev som humane hepatocytter, og for det andre tendensen til hepatocytter til raskt å dedifferensiere i 2D-kultur og dermed miste sin spesifikke hepatocyttfunksjon8. 3D leverkulturer er overlegne i denne forbindelse og har nylig blitt laget fra differensierte humane embryonale stamceller (hESCs) eller induserte pluripotente stamceller (hiPSCs)9. Bioengineered hepatiske 3D sfæroider er av spesiell interesse for å studere utvikling, toksisitet, genetiske og smittsomme sykdommer i leveren, samt i narkotikaforskning for behandling av leversykdommer10. Til slutt har de også potensial til å bli brukt klinisk, vel vitende om at akutte leversykdommer har en dødelighet på nesten 80%, bio-kunstig lever og / eller hepatiske sfæroider kan potensielt redde disse pasientene ved å gi delvis leverfunksjon til en passende donor kan bli funnet11.
Vi har etablert en protokoll for generering av humane hepatiske sfæroider ved bruk av blodavledede pluripotente stamceller (BD-PSCs) for å fremstille spheroider av forskjellig størrelse som inneholder 4000 til 1 x 106 celler og analysert dem ved hjelp av lysmikroskopi og immunfluorescens. Vi testet også evnen til hepatocyttspesifikk funksjon, og vurderte ekspresjonen av cytokrom P450 3A4 (CYP3A4) og 2E1 (CYP2E1) enzymer som tilhører cytokrom P450-familien som har viktige roller i cellulær og medikamentell metabolisme gjennom avgiftningsprosessen12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk godkjenning ble oppnådd (ACA CELL Biotech GmbH / 25b-5482.2-64-1) for å utføre disse eksperimentene, og informert samtykke ble signert av alle givere før blodutvinning i samsvar med institusjonelle retningslinjer.
1. Fremstilling av mononukleære celler (MNC) fra humant perifert blod (PB)
- Trekk ut 30 ml blod fra friske givere ved hjelp av utdannet medisinsk personell i henhold til standardprotokollen.
- Isoler PBMNCs ved hjelp av tetthetsgradientmedier i henhold til protokollen publisert av Becker-Kojić et al.13. Isoler, ved pipettering, interfaselaget mellom plasma og tetthetsgradientmedier og bruk sterilt fosfatbuffersaltvann (PBS) for å vaske de isolerte cellene.
- Bruk et tellekammer og tell antall celler ved hjelp av standardmetoder.
2. Dedifferensiering av MNCs ved aktivering med humant GPI-forankret glykoprotein
- Plasser 6 x 106 mononukleære celler i PBS / 1% bovint serumalbumin (BSA) i et polystyrenrør (15 ml) og inkuber med det spesifikke antistoffet i 30 minutter ved 37 ° C i henhold til Becker-Kojić et al.13.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g ved romtemperatur og erstatt PBS / BSA med Iscoves modifiserte Dulbeccos medium supplert med 10% føtal bovint serum (FBS).
- Dyrk cellene i 15 ml polystyrenrør i en 5% CO2 -inkubator ved 37 ° C i 8-10 dager som beskrevet i Becker-Kojić et al.13. På dag 5 (D5), tilsett 1-2 ml av Iscoves medium supplert med 10% FBS til hver 15 ml tube.
3. Sortering av nylig genererte dedifferensierte celler
- Sentrifuge dyrket cellesuspensjon ved romtemperatur i 10 minutter ved 300 x g og aspirere med en steril pipette, den resulterende supernatanten i henhold til Becker-Kojić et al.13.
- Resuspendere pellet oppnådd ved sentrifugering i 90 μL kald PBS-buffer (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA og 2 mM EDTA) og tilsett 10 μL CD45 positive magnetiske perler i nanostørrelse og inkuber på is i 15 minutter.
- Vask cellesuspensjonen med 2 ml PBS-buffer, sentrifuger den ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur og tilsett 500 μL PBS-buffer til cellene og resuspender grundig.
- Pipette 500 μL forkjølt PBS-buffer inn i kolonnen for å vaske og plassere den i magnetfeltet ved hjelp av et magnetisk stativ.
- Vask cellene som er plassert på kolonnen, to ganger med 500 μL PBS-buffer og samle gjennomstrømning som inneholder CD45-negative celler i Iscoves medium supplert med 10% FBS.
- Bruk et tellekammer for å bestemme antall omprogrammerte celler.
4. Fremstilling av glassdeksler for generering av humane hepatocytter
- Skill glassdeksler (14 mm) og inkuber dem i ikke-ionisk vaskemiddel i 10 minutter. Vask glassdeksler i avionisert vann til ingen bobler er igjen, og rug dem i 1M HCl i 30 minutter (tilpasset fra Marchenko et al.14).
- Vask glassdeksler med avionisert vann minst 3x og tørk dem over natten ved romtemperatur. Autoklav tørket glassdeksel glir i en egnet beholder.
5. Belegg cellekulturplater med biolaminin for 2D hepatisk differensiering av BD-PSCer
- Plasser autoklaverte glassdeksler med en steril pinsett i 4 brønnplater og slå på UV-lys i 30 minutter for å sikre sterile forhold.
- Tine alikoter av biolaminin og tilsett 120 μL av 5 μg / ml biolaminin til hver glassdeksel. La de belagte glassdekslene ligge over natten ved 4 °C.
- Fjern overskuddet av biolaminin og tilsett 200 μL hepatocytdifferensieringsmedium som beskrevet nedenfor.
6. Fremstilling av hepatocyttdifferensieringsmedier
- Lag 500 ml hepatoblast knockout serum erstatning (KSR) / dimetylsulfoksid (DMSO) medium bestående av 76,4% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 0,1% β-merkaptoetanol, 1% DMSO og 1% penicillin-streptomycin (Pen / Strep).
- Klargjør 500 ml hepatocyttmodningsmedium som inneholder 1% L-glutamin, 10 μM hydrokortison 21-hemisuccinatnatriumsalt (HCC) og 1% penn/streptokokker.
- Aliquot medium fra stammaterialet og tilsett fersk hepatocyttvekstfaktor (HGF) og onkostatin M (OSM) ved endelige konsentrasjoner på 10 ng/ml og/eller 20 ng/ml for hver mediumendring.
MERK: Oncostatin M er et cytokin som tilhører interleukin 6-gruppen av cytokiner, viktig for hematopoiesis samt for leverutvikling.
7. Dyrking av leverceller differensiert fra BD-PSC
- Sett 3 x 105 BD-PSCS-celler i hver brønn på en 4-brønns plate belagt med biolaminin.
- Plasser 4-brønnsplatene i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2. Dyrk cellene i 5 dager i KSR / DMSO hepatoblast medium som støtter endodermal differensiering og endre mediet annenhver dag.
- Bytt til hepatocyttmodningsmedium på dag 5 og dyrk cellene i ytterligere 7-10 dager i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2. Bytt medium hver 48.
8.3D sfæroid hepatisk differensiering
- Telle celler ved hjelp av et tellekammer.
- Sentrifuge BD-dedifferensiert cellesuspensjon ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatant og resuspender BD-dedifferensierte celler i KSR/DMSO medium ved 2 x 106 celler/ml.
- Før cellene gjennom en 40 μm cellesil for å sikre en enkeltcellesuspensjon og for å fjerne ytterligere rusk.
- Telle celler ved hjelp av et tellekammer og forberede et tilstrekkelig volum for hver celle såingstetthet for å dispensere det nødvendige volumet per brønn. Forbered en gradient med toppsåing av 1 x 106 celler til en lav såtetthet på 4000 celler.
- Dispenser 100 μL KSR/DMSO-medium i 96 godt lave festeplater og tilsett 100 μL cellesåingsfortynning.
- Plasser lav festeplate i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2 og dyrk dem i 5 dager.
- Bytt 50% av mediet fra dag 3-4 etter sådd når sfæroidene er tilstrekkelig kompakte.
- På dag 5, bytt medium til hepatocytt modningsmedium og kultur cellene i ytterligere 7-10 dager for videre modning. Bytt medium annenhver dag.
9. Immunfluorescensanalyse av nylig genererte 2D levercellekulturer
- Dyrk cellene i henhold til differensieringsmetoden beskrevet ovenfor i 4, 8, 15 og 24 dager og fjern media.
- Inkuber celler med forvarmet fiksativ bestående av 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter. Kast fikseringsmiddelet og vask cellene 2x med PBS i 5 minutter hver. Tilsett umiddelbart 0,1% triton X-100-løsning og permeabiliser cellene i 5 minutter. Vask 2x med PBS.
- Tilsett blokkeringsløsning laget av PBS og 5% BSA og legg på vippeplaten i 1 time ved romtemperatur.
- Fortynn primære antistoffer i fortynningsbuffer 1% BSA/PBS som følger: albumin (ALB) 1:50, alfa-1 fetoprotein (AFP) 1:250, cytokeratin 18 (CK18) 1:50, hepatocytt nukleær faktor 4 alfa (HNF4a) 1:1000 og transtyretin (TTR) 1:50. Bruk 50 μL antistofffortynning per brønn.
- Inkuber cellene i 1 time ved romtemperatur. Kast deretter antistoffoppløsningen, vask cellene i 5 minutter og gjenta vasketrinn 3x.
- Forbered følgende sekundære antistoffer i fortynningsbuffer: kanin anti-kylling IgG (Texas rød) 1:1000, geit anti-mus IgG (488) 1:1000, og geit anti-kanin (488) 1:500. Bruk 50 μL antistofffortynning per brønn og inkuber cellene i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask cellene 3x med PBS i 5 min hver og monter dekslene med monteringsmedier som inneholder DAPI for mikroskopisk analyse.
10. Levende farging av nydannede leversfæroider
- Kast forsiktig bort kulturmedier mens du ikke berører sfæroidene, tilsett nylaget PBS med 0,1% triton X-100-løsning, og inkuber i 5 minutter for å permeabilisere cellene.
- Vask sfæroidene med mediet ved å pipettere sakte i 5 minutter, gjenta 2x.
- Inkuber sfæroidene med de primære antistoffene ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) og CYP3A4 (1:200) fremstilt i PBS med 1% BSA i 1 time i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Bruk 50 μL antistofffortynning per brønn.
- Fjern forsiktig overflødig antistoffoppløsning og vask sfæroidene med medium 3x.
- Forbered de tilsvarende sekundære antistoffene geit anti-mus IgG (Cy3), geit anti-mus IgG (488) og kanin anti-kylling IgG (Texas rød) ved en fortynning på 1:1000 og 1:500 for geit anti-kanin (488) i PBS i 1% BSA. Bruk 50 μL antistofffortynning per brønn og inkuber i 20 minutter i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2.
- Vask forsiktig 3x med medium og la platen stå i 30 minutter i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2 før du utfører fluorescensmikroskopi.
11. Undersøkelse av sfæroider ved hjelp av et fluorescensmikroskop
- Slå på fluorescenslyskilden 10 minutter før bruk, slå på datamaskinen og åpne bildebehandlingsprogramvaren.
- Bruk et objektiv med 4x forstørrelse, klikk på knapp 4x i verktøylinjen for å ha riktig skalalinje valgt, og plasser deretter 96-brønnplaten på scenens midtplate.
- Slå på LED-lyskilden, bruk brightfield-filteret og plasser platen til brønnen av interesse ved hjelp av x-y-aksen trinnjusteringsknappen.
- Bytt til kameraets lysbane, klikk på knappen Live in imaging-programvare for å visualisere bildet på skjermen, og sørg for at sfæroiden er sentrert ved hjelp av x-y-akseknappene og fokus ved hjelp av grov / fin fokusknapp.
MERK: Formen på sfæroidene forblir konstant etter påføring av levende farging. - Velg Brightfield Observation-metoden på verktøylinjen, sett eksponeringsinnstillingene til automatisk, og klikk på knappen Snapshot i kameraets kontrollpanel for å ta et bilde. Lagre deretter bildet som .vsi-fil ved å bruke riktig navn i mappen av interesse.
- Plasser omgivelseslys skjermingsplate for å slå av LED-lys, bytt til filter for B-excitasjon, velg 488 observasjonsmetode i verktøylinjen, åpne lukkeren, ta et bilde ved å klikke på knappen Snapshot, lukk lukkeren, og lagre filen som beskrevet ovenfor.
- Gjenta dette med et filter for G-eksitasjon ved bruk av riktig observasjonsmetode (Texas rød eller CY3). Gjenta deretter hele prosedyren for hver brønn av interesse.
- Sett platen tilbake til 5 % CO2 -inkubatoren ved 37 °C og dyrk den som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi differensierte vellykket humane BD-PSCer til endoderm / hepatiske stamceller og hepatocytter ved å anvende en to-trinns protokoll. Morfologiske endringer under den hepatiske differensieringsprosessen er vist i figur 1. BD-PSC skiller seg ut i hepatocytter som går gjennom tre forskjellige stadier. Den første fasen representerer differensieringen i endodermale celler L4, den andre, differensiering til leverprogenitorceller (hepatoblast) L8, som viser en typisk polygonal morfologi, og den tredje, modningen til hepatocytter L15-L24.
Immunfluorescensanalyse ble utført for å bekrefte leverdifferensiering av BD-PSC som presentert i figur 2. Sterkt uttrykk for endoderm / human leverprogenitormarkør, som alfa-fetoprotein (AFP), et viktig plasmaprotein i føtal serum hvis konsentrasjon er svært lav hos voksne organismer og derfor betraktes som en markør for hepatocytters forløper15 og transtyretin (TTR), et viktig skjoldbruskhormonbindende protein involvert i transport av tyroksin fra blodet til hjernen16 finnes i cellene i første fase av leverdifferensieringsprosessen ved L4 til L8. Imidlertid reduseres uttrykket ved L15, mens ekspresjonen av albumin (ALB), det rikeste plasmaproteinet som produseres hovedsakelig av leveren og helt kritisk for leverdifferensiering, samt hepatocytt nukleær faktor 4 alfa (HNF-4a), en hepatocytter transkripsjonsfaktor som er involvert i ekspresjonen av leverspesifikke gener17 vises først ved L4, stiger gjennom differensieringstiden L4-L15 og når et sterkt og stabilt uttrykk i løpet av modningstiden L15-L24.
Cytokeratin 18 (CK18) er et cytoskjelettprotein, en av hovedkomponentene i mellomliggende filament uttrykt i leveren18. Resultatene viser at, som forventet, korrelerer CK18-ekspresjon med modne hepatocytter (L15-L24), og det uttrykkes ikke i hepatocyttprogenitorceller.
Den veldefinerte protokollen for hepatocyttdifferensiering i 2D-kulturer muliggjør konstruksjon av hepatiske 3D-kulturer som starter med BD-PSCer.
Vi demonstrerer her at spontan aggregering av disse cellene i lavfesteplater inneholdende hepatocyttinduksjon/modningsmedium initierer sfæroiddannelse. Vekstsporet ble etterfulgt av avbildningsceller ved L2, L4 og L7. (Figur 3A) Det er en konsistent korrelasjon mellom sfæroidvolum og variabelt antall celler, som presentert i figur 3B.
Leveren er et organ der de fleste legemidlene i menneskekroppen metaboliseres. Cytokrom P450 er en superfamilie av enzymer (monooksygenaser) som er av sentral betydning i prosessene for medikamentell og cellulær metabolisme, avgiftning av xenobiotika og homeostase. For å vurdere den potensielle funksjonelle aktiviteten til BD-PSCs avledede hepatiske sfæroider, analyserte vi ekspresjonen av legemiddelmetaboliserende enzymer som CYP3A4 og CYP2E1, medlemmer av CYP3- og CYP2-familiene19.
De fleste legemidlene som brukes i dag, inkludert kodein, ciklosporin A, erytromycin, paracetamol og diazepam, samt mange steroider og kreftfremkallende stoffer, metaboliseres på grunn av aktiviteten til CY3A4-enzym20. CYP2E1 er involvert i metabolismen av endogene substrater som etylenglykol, benzen, karbontetraklorid, og spesielt den viktigste svært mutagene forbindelsen som nitrosamin21.
Sfæroidene som dannes og differensieres i henhold til protokollen ved D14, levende farget med antistoffer mot disse to enzymene, avslører den potensielle leverfunksjonelle aktiviteten til BD-PSCs-avledede sfæroider (figur 4).
Figur 1: Differensiering av BD-PSC til leverlignende celler. Representative mikrografer av morfologiske endringer gjennom hepatisk differensiering av BD-PSC viser endodermal L4, eller polygonal form L8-morfologi som endelig når modningstilstand ved L15 til L24. Skalastenger: øvre rad 50 μm, nedre rad 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Immunfluorescensanalyse av BD-PSCs redifferensiering mot leverceller. Endoderm / hepatocytter, stamfar og hepatocytter spesifikke markører uttrykkes under leverdifferensiering av BD-PSCs i 2D-kulturer. Dag L4 til L8 viser mikrografer redusert ekspresjon av endoderm/leverstamfar AFP og TTR, mens uttrykket forsvant fra L8-L24. Ekspresjon av hepatocytter ALB og HNFα-markører oppstår ved L4 og øker under modning, mens uttrykket av CK18 først dukket opp ved L15 og nådde maksimum ved L24. Skalastenger for grafer L4-L15: 50 μm og for L24: 20 μm. Kontroll er presentert i tilleggsfigur 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Dannelse av 3D-sfæroider ved leverdifferensiering av BD-PSC. (A) Variable celletall av BD-PSCer som startet med 1 x 106 til 4000 celler ble sådd til lave festeplater, og differensiering ble utført i henhold til totrinnsprosedyren som angitt i protokollen. Genereringen av 3D humane leversfæroider ble avbildet på forskjellige tidspunkter, vist er representative fasekontrastbilder på hvert tidspunkt i kulturperioden. Skala bar: 200 μm. (B) Diametere på minst 4 hepatiske sfæroider for hver størrelse ble målt ved L4 ved hjelp av mikroskopavbildningsprogramvare og volumer ble beregnet. Feilfelt viser standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Hepatocyttfunksjonelle markører uttrykkes i BD-PSCs-deriverte leversfæroider. BD-PSC ble differensiert til hepatocytter. Direkte immunfluorescensanalyse ble utført på levende celler ved L14 ved bruk av antistoffer mot ALB, AFP, CK18 og CYP2E1 og CYP3A4, medlemmer av cytokrom P450-familien. Skala bar: 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Negativ kontroll for immunfluorescensanalyse av BD-PSCs redifferensiering mot leverceller. Endoderm / hepatocytter, stamfar og hepatocytter spesifikke markører uttrykkes under leverdifferensiering av BD-PSCs i 2D-kulturer. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leveren er et viktig organ i menneskekroppen med mange viktige biologiske funksjoner, for eksempel avgiftning av metabolitter. På grunn av alvorlig leversvikt som skrumplever og / eller viral hepatitt, er det nesten 2 millioner dødsfall per år over hele verden. Levertransplantasjoner rangerer andre i solide organtransplantasjoner over hele verden, men bare ca 10% av dagens behov er oppfylt22.
Primære humane hepatocytter (PHH) brukes ofte til å studere levertoksisitet. Disse cellene kan opprettholdes i kultur i kort tid og beholde sine spesifikke funksjoner. Også antall celler tilgjengelig fra en enkelt donor er begrenset, i tillegg kan disse cellene ikke utvides i kulturen, derfor er mangelen på donor PHH fortsatt det største hinderet for levertoksisitetsstudier. PSC representerer en fornyelseskilde for humant vev og kan brukes til generering av 3D leverkulturer11.
Lever 3D-kultursystemer viser flere fordeler sammenlignet med 2D. Kortere differensieringstid og nøyaktig etterligning av in vivo-prosesser muliggjør mer presise studier av legemiddelindusert toksisitet, bedre prediksjon av leveransvar og er mer kostnadseffektive23. Leversfæroidkulturer på grunn av deres autologe trekk kan være en stor fordel i forhold til primære humane hepatocytter (PHH) som omgår ulempene knyttet til bruken av dem og kan bli en gullstandard for anvendelse ved testing av legemiddeltoksisitet og har en potensiell fremtidig anvendelse i regenerativ medisin.
Vi har her vist at BD-PSC generert fra steady-state perifert blod med hell kan differensieres til endodermale / hepatocyttprogenitorer / modne hepatocytter med jevn albuminsekresjon og fenotypisk stabilitet som uttrykker hepatocyttmarkører. Videre demonstrerer de konstruerte 3D humane hepatocytt sfæroidkulturene den potensielle funksjonelle aktiviteten ved å uttrykke enzymer som tilhører cytokrom P450, som CYP3A4 og CYP2E1.
Det viktigste trinnet i protokollen er å oppnå god kvalitet og antall ferske menneskelige MNCer for omprogrammeringsprosessen. Bruk av frosne MNCs resulterer i et redusert antall omprogrammerte celler.
Vi har utviklet humane leversfæroider ved hjelp av aktiverte PBMNC-kulturer med og uten å bruke immunomagnetisk sortering som skiller omprogrammerte celler fra modne blodceller. Den lille forskjellen i bruk av disse to metodene er avhengig av den høyere tettheten av 3D-struktur når du bruker rensede omprogrammerte celler. Ekspresjonen av hepatocyttmarkører forblir konsistent i begge cellekulturpreparatene.
På grunn av den begrensede tilgjengeligheten av PHH, representerer metoden potensielt det biologisk relevante nærmeste alternativet til autologe ferske hepatocytter for å studere leverfunksjon in vitro , som xenobiotiske metabolismer og levertoksisitet, vertspatogenintervensjon og cellebiologi generelt. Muligheten for å bruke BD-PSC i regenerativ medisin samtidig som den er autolog og ikke-teratogen er gjenstand for videre studier i vårt laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den tilsvarende forfatteren erklærer at hun er patentinnehaver relatert til Novel humant GPI-koblet protein. Hun var med på å grunnlegge og jobbe med ACA CELL Biotech GmbH. De andre forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne er spesielt takknemlige for den tekniske assistansen fra Oksana og John Greenacre. Dette arbeidet ble støttet av ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F.
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S.
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
