Analisi semi-automatica dell'ampiezza e della latenza di picco per le forme d'onda di risposta uditiva del tronco encefalico utilizzando R

Summary

Questo articolo descrive la misurazione semi-automatica delle ampiezze e delle latenze dei primi cinque picchi e depressioni nella forma d’onda della risposta uditiva del tronco cerebrale. Una routine aggiuntiva compila e annota i dati in un foglio di calcolo per l’analisi dello sperimentatore. Queste routine informatiche gratuite vengono eseguite utilizzando il pacchetto statistico open source R.

Abstract

Molti rapporti negli ultimi 15 anni hanno valutato i cambiamenti nella forma d’onda della risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) dopo insulti come l’esposizione al rumore. I cambiamenti comuni includono riduzioni dell’ampiezza del picco 1 e delle latenze relative dei picchi successivi, nonché un aumento del guadagno centrale, che si riflette in un aumento relativo delle ampiezze dei picchi successivi rispetto all’ampiezza del picco 1. Molti sperimentatori identificano visivamente i picchi e le depressioni per valutare le loro altezze e latenze relative, che è un processo laborioso quando le forme d’onda vengono raccolte in incrementi di 5 dB in tutta la gamma uditiva per ogni frequenza e condizione. Questo documento descrive routine libere che possono essere eseguite nella piattaforma open source R con l’interfaccia RStudio per semi-automatizzare le misurazioni dei picchi e delle depressioni delle forme d’onda della risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR). Le routine identificano le ampiezze e le latenze di picchi e depressioni, le visualizzano su una forma d’onda generata per l’ispezione, raccolgono e annotano i risultati in un foglio di calcolo per l’analisi statistica e generano forme d’onda medie per le figure. Nei casi in cui il processo automatizzato identifichi erroneamente la forma d’onda ABR, esiste uno strumento aggiuntivo per assistere nella correzione. L’obiettivo è ridurre il tempo e gli sforzi necessari per analizzare la forma d’onda ABR in modo che più ricercatori includano queste analisi in futuro.

Introduction

La risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) viene spesso utilizzata per determinare le soglie uditive nei soggetti animali e nei neonati umani. Poiché l’ABR è una registrazione elettroencefalogramma (EEG) delle prime risposte del sistema nervoso agli stimoli uditivi, trasporta informazioni aggiuntive che riflettono l’attivazione coordinata dei neuroni ganglio a spirale cocleare e l’elaborazione precoce del segnale nel tronco cerebrale uditivo, compresa l’elaborazione bilaterale¹. Queste risposte possono essere influenzate da traumi da rumore. Ad esempio, l’esposizione al rumore che è sufficiente a indurre uno spostamento temporaneo della soglia nei topi può anche ridurre in modo permanente l’ampiezza del picco ABR 1². Inoltre, tale trauma può ridurre le latenze interpeak e aumentare le ampiezze relative dei picchi successivi³, probabilmente a causa di una perdita della regolazione inibitoria⁴. Oltre a questi risultati, specifiche mutazioni genetiche hanno dimostrato di alterare la forma d’onda ABR in assenza di trauma ^5,6,7. Pertanto, l’analisi di routine delle forme d’onda ABR può fornire informazioni sul sistema uditivo nei modelli sperimentali.

C’è stato anche interesse nell’uso delle forme d’onda ABR come strumento diagnostico per i pazienti. Precedenti studi hanno valutato se il picco ABR 1 è ridotto nei pazienti umani dopo esposizione al rumore o nei pazienti con acufene ^8,9. In particolare, è stato riportato che gli attacchi di emicrania aumentano temporaneamente le latenze interpeak per diverse settimane, dopo di che la forma d’onda ABR ritorna normale negli individui affetti¹⁰. È stato riportato che COVID-19 guida alterazioni a lungo termine nelle latenze ABR interpeak 11,12^, sebbene un altro studio abbia riportato risultati diversi¹³. La perdita dell’udito è spesso co-morbida con la demenza nell’invecchiamento e gli individui con maggiore perdita dell’udito tendono a sperimentare la demenza che avanza più rapidamente¹⁴. I ricercatori hanno studiato i cambiamenti della forma d’onda ABR nelle malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson (rivisto in Jafari et al.15) e il morbo di Alzheimer (rivisto in Swords et al.16), così come nel normale invecchiamento ¹⁷. Man mano che sempre più ricercatori e medici studiano i deficit sensoriali come biomarcatori per le malattie comuni nell’invecchiamento, tecniche come l’ABR possono diventare di routine nell’assistenza sanitaria.

Un esame delle sezioni dei metodi in letteratura rivela che i laboratori spesso scrivono script personalizzati in MatLab per analizzare le forme d’onda ABR. La piattaforma ABR realizzata da Intelligent Hearing Systems ha una funzione per l’analisi delle forme d’onda, ma richiede che un operatore selezioni manualmente i picchi e le depressioni. Qui, abbiamo scritto routine di analisi semi-automatiche per l’ambiente statistico open source e liberamente disponibile R e l’interfaccia RStudio. Questo rapporto confronta i dati ottenuti utilizzando le nostre routine con i dati ottenuti facendo identificare manualmente i picchi e le depressioni da uno sperimentatore e mostra che i dati dei due metodi sono fortemente correlati. È importante sottolineare che le routine incorporano una funzione di accecamento, in cui i metadati per gli esempi vengono inseriti in un file separato che non viene incorporato fino alla fine. Queste funzioni hanno semplificato l’analisi delle forme d’onda per il nostro laboratorio.

Protocol

Tutte le procedure eseguite sugli animali sono state approvate in anticipo dal Comitato per la ricerca sugli animali dell’Università di Rochester. I soggetti sperimentali erano 12 topi maschi e femmine F1 wild-type a 1 mese di età. Questi topi F1 sono il prodotto dell’accoppiamento di una diga CBA / CaJ e di un padre C57BL / 6J. I topi sono stati allevati e alloggiati nella struttura del vivaio con un ciclo standard di luce / buio di 12 ore, cibo e acqua illimitati e ampie scorte di nidificazione. Non più di cinque fratelli dello stesso sesso sono stati alloggiati insieme in una gabbia. 1. Ottenimento dei dati per l’analisi NOTA: Questo passaggio deve essere conforme alle linee guida istituzionali ed essere pre-approvato dal comitato istituzionale per il benessere degli animali. Il processo dettagliato per generare dati ABR dai topi è stato descritto altrove18. Registra l’ABR con la piattaforma scelta.NOTA: nell’istanza mostrata qui, le registrazioni sono state eseguite su topi.Utilizzare uno stimolo di clic di 5 ms a partire da un livello di pressione sonora di 75 dB e decrescente in incrementi di 5 dB a 5 dB. Registrare una media di 512 sweep per ogni ampiezza. Rifiutare le risposte se il loro picco all’ampiezza minima è maggiore di 31 μV in qualsiasi istanza tra 1,3 ms e 12,5 ms dopo lo stimolo.NOTA: Possono essere utilizzate anche registrazioni da presentazioni di tone pip. Prevediamo che la routine di analisi funzionerà per altre specie, compresi gli esseri umani. Esportare la registrazione ABR come file ASCII.Per IHS, aprire il programma per computer. Carica il file di interesse e visualizza le forme d’onda desiderate su una pagina. Nella scheda Dati selezionare Salva pagina come ASCII per ottenere un file .txt. Dopo aver nominato il file di dati in modo appropriato (“ID”), registrare l’ID e le informazioni sull’oggetto in un file di metadati intitolato “info.csv”. Assicurarsi che l'”ID” non includa informazioni quali il genotipo, il sesso, l’età o il trattamento; Queste informazioni sono invece registrate in “Info.csv”.NOTA: Un discreto mazzo di carte da gioco può essere utilizzato per assegnare in modo casuale le etichette, se necessario. Ripetere l’operazione con tutti i file da analizzare come file “ID” separati. 2. Installazione dei pacchetti richiesti e caricamento dei dati sul computer funzionante Scarica e installa R (https://www.r-project.org) e RStudio (https://www.rstudio.com).Nota : il protocollo descritto qui utilizzato R ≥ 4.0.0. Installare le librerie richieste, tidyverse, shiny, plotly e zoo, digitando il seguente comando nella finestra di comando di RStudio:Install.packages(“tidyverse”)Install.packages(“shiny”)Install.packages(“plotly”)Install.packages(“zoo”) Scarica gli script FindPeaks.R e See_trace_click. R dal laboratorio bianco GitHub (https://github.com/PWhiteLab/FindPeaks), nonché dal file associato “Time.csv”. Creare una nuova cartella contenente tutti i file ASCII, “info.csv” e “Time.csv”. Per questo esempio, assegnare alla cartella il nome “Test_Folder”. All’interno di “Test_Folder”, inserire i file ASCII in una sottocartella denominata “ASCII_Folder”. 3. Ottenere l’analisi preliminare con FindPeaks.R Aprire lo script FindPeaks.R in RStudio. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda relativa allo script nella barra degli strumenti per selezionare Imposta directory di lavoro e impostarlo su Test_Folder (vedere Figura supplementare S1A). Nella finestra dello script , fare clic su Source nella parte superiore destra della barra degli strumenti per caricare il programma (vedere la figura supplementare S1B). Nella finestra di comando, utilizzare i seguenti comandi per analizzare le forme d’onda (vedere la Figura supplementare S2):FindPeaks_single(“ASCII_folder/ID.txt”) per singoli file (vedere la figura supplementare S2A)FindPeaks_group(“ASCII_Folder”) per l’elaborazione in batch (cfr. figura supplementare S2B)NOTA: Lo script produrrà (1) file pdf che mostrano le forme d’onda con picchi e depressioni etichettati (vedere la figura supplementare S2C) e (2) un file ID.csv contenente i dati numerici per l’ampiezza (μV) e la latenza (ms). Entrambi i file verranno inseriti in “Test_Folder”. 4. Verifica dell’analisi preliminare NOTA: A bassi livelli sonori, parti della forma d’onda possono diventare difficili da distinguere dal rumore e FindPeaks.R può identificare erroneamente i picchi o le depressioni rispetto all’opinione dello sperimentatore. Se c’è una discrepanza, il file .csv può essere modificato con i dati ottenuti dallo script See_trace_click.R. Caricare i dati della forma d’onda per l’individuo specifico utilizzando il comando (vedere la figura supplementare S3A):Forma d’onda <- ASCII_extract("ASCII_Folder/ID.txt") Aprire il See_trace_click. R script in RStudio. Nell’intestazione a sinistra, fai clic sul pulsante Esegui app e attendi che venga visualizzata una nuova finestra interattiva (lucida) (vedi Figura supplementare S3B). Nella casella in alto a sinistra, inserisci il livello sonoro per la forma d’onda che richiede la revisione e cerca la forma d’onda visualizzata nella finestra. Sposta il cursore attorno alla forma d’onda per rivelare la latenza e l’ampiezza in qualsiasi punto. Fare clic sul picco corretto e sul seguente trogolo per registrare i dati nella tabella sottostante. Copiare e incollare i dati di latenza nel file .csv (vedere la figura supplementare S3C). Per calcolare la misurazione dell’ampiezza, sottrarre l’ampiezza del seguente trogolo dall’ampiezza di picco nella cella del foglio di calcolo. 5. Compilazione e visualizzazione del set di dati Trasferire i file .csv verificati in una nuova sottocartella in Test_Folder intitolata “Peak_Data”. Aggiungere i dati in un singolo file .csv e denominarlo “Peak_Data.csv”. Utilizzare il seguente comando:Compilare (“Peak_Data”)Nota : questo script combina i metadati da info.csv con Peak_Data.csv per etichettare i dati con informazioni di gruppo. Inoltre, calcola automaticamente le latenze tra i picchi e i rapporti di ampiezza. Eseguire analisi statistiche sui dati compilati.Utilizzare un test di normalità, come il test di Shapiro-Wilks, per valutare la distribuzione dei dati con la seguente funzione:shapiro.test() Se il test di Shapiro-Wilks non è significativo, il set di dati ha una distribuzione normale; quindi, valutare i dati con un test parametrico come ANOVA con la seguente funzione:aov() Se il test di Shapiro-Wilks è minore di p = 0,05, usare il test della somma dei ranghi di Kruskal-Wallis (con la funzione sotto) o un’altra misura non parametrica appropriata (vedi altre possibilità nella discussione).kruskal.test() Per visualizzare le forme d’onda medie, utilizzare il seguente comando:Average_Waveform(“ASCII_Folder “, aes(x = Data_Pnt_ms, y = “dB”, group = Genotipo, colore = Genotipo))NOTA: questo comando mostra le forme d’onda medie per diversi genotipi in diversi colori. Per la variabile y dB, inserire il numero corrispondente all’ampiezza desiderata, ad esempio 75, senza virgolette. Per altri confronti, utilizzare l’etichetta di gruppo corrispondente dai metadati.

Representative Results

Abbiamo testato le routine sulle risposte della forma d’onda ABR a una serie di clic, partendo da 75 dB e scendendo con incrementi di 5 dB fino a 5 dB. Questi dati sono stati ottenuti come descritto in precedenza19. Abbiamo anche testato lo strumento sui dati del tono pip e ottenuto risultati simili. I dati ABR della maggior parte dei sistemi ABR possono essere esportati come file .txt (ASCII). Abbiamo caricato i file ASCII ABR su un computer e li abbiamo aperti in RStudio come descritto nel protocollo. Dopo aver eseguito la routine FindPeaks.R in forma batch, abbiamo ottenuto forme d’onda campione con etichettatura automatica (Figura 1) e un file .csv con i risultati. I risultati sono stati esaminati per rimuovere picchi irrilevanti. Per convalidare l’etichettatura automatica, abbiamo anche utilizzato la funzionalità del programma ABR per etichettare manualmente i primi cinque picchi e depressioni su ciascuna forma d’onda ottenuta con la serie di clic sopra descritta. Lo sperimentatore che eseguiva questo compito aveva 2 anni di esperienza nella registrazione e nell’analisi dei dati ABR. La Figura 2 mostra questo confronto, con i dati automatizzati di FindPeaks.R in rosso e i dati ottenuti manualmente in nero. Ogni traccia rappresenta i dati di un singolo mouse. Viene visualizzata anche la media per entrambi i metodi con una deviazione standard. I risultati ottenuti da FindPeaks.R sono fortemente correlati con i risultati ottenuti manualmente (vedere la figura supplementare S4). Figura 1: Risposta rappresentativa della forma d’onda a uno stimolo di clic di 75 dB per un giovane mouse F1. La latenza in millisecondi viene tracciata sull’asse x e l’ampiezza in microvolt viene tracciata sull’asse y. I picchi sono stati identificati automaticamente con FindPeaks.R e sono etichettati in rosso, mentre i trogoli sono etichettati in blu. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Confronto dei dati ottenuti dai picchi identificati manualmente con i dati forniti dall’analisi FindPeaks.R. (A,C,E,G,I) Le ampiezze in microvolt e le latenze (B,D,F,H,J) in millisecondi sono tracciate per livelli sonori compresi tra 5 dB e 75 dB (asse x, tutti i grafici) per i picchi I-V nelle forme d’onda ottenute per gli stimoli di clic presentati a 12 topi. I valori ottenuti manualmente (nero) vengono confrontati con gli stessi set di dati analizzati con FindPeaks.R (rosso). Le medie sono tracciate come linee pesanti, con la regione ombreggiata che rappresenta una deviazione standard. Non sono state osservate differenze tra i metodi valutati con il test della somma dei ranghi di Kruskal-Wallis (A, differenza = 0,0547977 ± 0,0010028, max = 0,96, p = 0,9216; B, differenza = −0,0001734 ± 0,0001214, max = 0,04, p = 0,8289; C, differenza = −0,0212209 ± 0,0006806, max = 0,92, p = 0,9687; D, differenza = −0,0011047 ± 0,0001556, max = 0,06, p = 0,771; E, differenza = −0,0323077 ± 0,0006169, max = 0,66, p = 0,899; F, differenza = −0,0072189 ± 0,0001460, max = 0,04, p = 0,8644; G, differenza = 0,201754 ± 0,0007407, max = 0,64, p = 0,9312; H, differenza = −0,0007018 ± 0,0001717, max = 0,09, p = 0,8013; I, differenza = 0,0347561 ± 0,0007343, max = 1,05, p = 0,8856; J, differenza = −0,0078049 ± 0,0002762, max = 0,16, p = 0,886), e i risultati erano altamente correlati (valori del chi quadrato: A, 0,009696; B, 0,046684; C, 0,0015395; D, 0,084742; E, 0,016102; F, 0,029153; G, 0,0074604; H, 0,063322; I, 0,020699; J, 0,020544; differenze presentate come media ± SEM; max = differenza massima assoluta). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura supplementare S1: Analisi con FindPeaks.R. (A) Selezione della directory di lavoro (cfr. fase 3.2 del protocollo); (B) caricamento del programma (vedere il passaggio del protocollo 3.3). Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare S2: Output di script e comandi per l’analisi delle forme d’onda. Comandi per (A) singoli file e (B) elaborazione batch. (C) File PDF di output che mostra forme d’onda con picchi e depressioni etichettati. Vedere il passaggio del protocollo 3.4. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare S3: Verifica dell’analisi. (A) Caricamento dei dati della forma d’onda (vedere il punto 4.1 del protocollo). (B) Posizione del pulsante Esegui app . Viene inoltre indicato il file di dati di esempio. (C) Finestra lucida con una forma d’onda. In questo caso, il livello sonoro è di 75 dB, come indicato nella finestra superiore. Facendo clic su un picco desiderato e il seguente trogolo vengono registrati i dati per l’ampiezza e la latenza nella tabella (passaggio del protocollo 4.6). Vengono mostrati i dati del picco 3. Clicca qui per scaricare questo file. Figura supplementare S4: Confronto dei singoli dati ottenuti dai picchi identificati manualmente con i dati forniti dall’analisi FindPeaks.R. (A,C,E,G,I) Le ampiezze in microvolt e le latenze (B,D,F,H,J) in millisecondi sono tracciate per livelli sonori compresi tra 5 dB e 75 dB (asse x, tutti i grafici) per i picchi I-V nelle forme d’onda ottenute per gli stimoli di clic presentati a 12 topi. Ogni animale è etichettato con un colore unico, come mostrato nella legenda. I dati ottenuti con FindPeaks.R sono etichettati con colori a tinta unita, mentre i dati ottenuti manualmente sono etichettati con versioni meno sature degli stessi colori. Mentre entrambi i set di dati sono tracciati in questa figura, quando sono identici, è evidente solo una riga. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Il protocollo descritto in questa pubblicazione dovrebbe aiutare a semplificare l’acquisizione dei dati che descrivono i rapporti di ampiezza della tensione e gli intervalli di latenza per ABR a clic e pip di tono. Utilizzando singoli comandi in RStudio, uno sperimentatore può estrarre, compilare e visualizzare queste informazioni in un unico documento per l’analisi statistica. Rendendo questa analisi di routine, speriamo che il campo scopra nuovi modi in cui l’ABR può essere alterato nello sviluppo, nell’invecchiamento o per insulto in diverse specie. Tali informazioni potrebbero essere preziose per identificare importanti meccanismi simili alla sinaptopatia da rumore². I giovani topi utilizzati per questo esperimento hanno avuto risposte molto variabili, probabilmente perché il tronco cerebrale uditivo sta ancora maturando a questa età^{di 20} anni. Tuttavia, i due metodi di quantificazione hanno mostrato correlazioni molto forti (Figura 2).

Lo script utilizza un file chiamato “Time.csv” per impostare intervalli all’interno dei dati per l’identificazione dei picchi. In breve, un’ampiezza di tensione massima che si verifica in un intervallo di tempo specificato è etichettata come “picco 1”, una minima tensione che si verifica nell’intervallo successivo è etichettata “depressione 1” e così via. Abbiamo scelto gli intervalli per comprendere le latenze delle risposte pip sia click che tone per topi CBA / CaJ di età compresa tra 1 mese e 12 mesi utilizzando frequenze che vanno da 8 kHz a 32 kHz. Abbiamo utilizzato con successo lo strumento per misurare anche le risposte dei pip nei tono. Anche altre specie, compresi gli esseri umani, hanno risposte ABR all’interno di finestre simili e prevediamo che questo strumento possa essere utilizzato anche per i dati di altre specie. Raccomandiamo di utilizzare il nuovo metodo ABR parallelo per gli esseri umani²¹, che produce forme d’onda eccellenti. La limitazione dell’intervallo di tempo limita l’uso di questo strumento alla valutazione delle risposte ABR immediate. Notiamo tuttavia che i dati di intervallo in questo file potrebbero essere modificati dagli utenti per automatizzare le misurazioni delle risposte ABR al parlato o dei potenziali correlati agli eventi (ERP) che si verificano tipicamente in momenti diversi in risposta al suono.

Vale la pena evidenziare alcune caratteristiche del trattamento statistico di questi dati. Per quanto ne sappiamo, il campo non ha un trattamento standardizzato per distinguere le progressioni di ampiezza. I primi studi hanno utilizzato ANOVA^22,23. I dati della serie di clic qui (Figura 2) erano non parametrici, portando all’uso del test della somma dei ranghi di Kruskal-Wallis. Analogamente ad ANOVA, il test della somma dei ranghi di Kruskal-Wallis valuta le differenze nei valori ottenuti a un dato livello di stimolo; cioè, confronta le linee ottenute sul grafico. Tuttavia, sono possibili anche altri trattamenti. Biologicamente, le progressioni di ampiezza riflettono il reclutamento aggiuntivo di neuroni a soglia più alta all’aumentare del livello di stimolo. Ciò suggerisce che l’area sotto la curva, che rappresenta gli integrali delle linee, potrebbe essere la misura più rilevante. Le equazioni di stima generalizzate (GEE) possono essere utilizzate per modellare i singoli dati per un’analisi integrale, come in Patel et ^al.5. In particolare, l’analisi GEE può prendere in considerazione la progettazione di misure ripetute di questi esperimenti. Man mano che sempre più ricercatori discutono i metodi di analisi dei dati, prevediamo l’emergere di un consenso sulle migliori pratiche.

In conclusione, questo documento presenta strumenti gratuiti e facili da usare per misurare, compilare e visualizzare le forme d’onda ABR. Questi strumenti possono essere utilizzati dagli studenti alle prime armi di RStudio seguendo questo protocollo e incorporano un passaggio accecante per migliorare il rigore e la riproducibilità. Prevediamo che l’analisi di routine della forma d’onda ABR consentirà la scoperta di insulti, varianti genetiche e altri trattamenti che possono influenzare la funzione uditiva.

Materials

C57BL/6J  mice	Jackson Labs	664
CBA/CaJ mice	Jackson Labs	654
E-series PC	Dell	n/a (this equipment was discontinued)	This runs the IHS system.
Mini-anechoic chamber	Industrial Acoustics Company	Special order number 104306	This enclosure reduces noise levels for auditory testing of animals.
Optiplex 7040	Dell	i5-6500	Rstudio may also be run on a Mac or Linux system.
Universal Smart Box	Intelligent Hearing Systems	n/a (this equipment was discontinued)	Both TDT and IHS can output hearing data as ASCII files.