Desenho e Implementação de um Modelo de Perfusão Pulmonar Ex Vivo de Rato

Summary

Os pulmões ex vivo são úteis para uma variedade de experimentos para coletar dados fisiológicos, excluindo as variáveis de confusão dos experimentos in vivo . As configurações comerciais geralmente são caras e limitadas nos tipos de dados que podem coletar. Descrevemos um método para construir uma configuração totalmente modular, adaptável para vários projetos de estudo.

Abstract

As preparações pulmonares ex vivo são um modelo útil que pode ser traduzido para muitos campos diferentes de pesquisa, complementando os modelos in vivo e in vitro correspondentes. Os laboratórios que desejam usar pulmões isolados precisam estar cientes das etapas importantes e dos desafios inerentes para estabelecer uma configuração acessível, confiável e que possa ser facilmente adaptada para se adequar ao tópico de interesse. Este artigo descreve um modelo DIY (faça você mesmo) para ventilação e perfusão pulmonar ex vivo de ratos para estudar os efeitos de drogas e gases no tônus vascular pulmonar, independentemente de alterações no débito cardíaco. A criação deste modelo inclui a) o projeto e a construção do aparelho e b) o procedimento de isolamento pulmonar. Esse modelo resulta em uma configuração mais econômica do que as alternativas comerciais e, no entanto, modular o suficiente para se adaptar a mudanças em questões específicas de pesquisa. Vários obstáculos tiveram que ser resolvidos para garantir um modelo consistente que seja capaz de ser usado para uma variedade de tópicos de pesquisa diferentes. Uma vez estabelecido, esse modelo provou ser altamente adaptável a diferentes questões e pode ser facilmente alterado para diferentes campos de estudo.

Introduction

As técnicas de perfusão pulmonar ex vivo (EVLP)¹ tiveram um aumento no uso na última década como meio de estudar transplantes pulmonares², isquemia/reperfusão³, metabolismo pulmonar⁴ e respostas imunes⁵. Pulmões isolados, mas intactos, ventilados e perfundidos oferecem a capacidade criticamente importante de avaliar diretamente a resposta dos pulmões, incluindo a vasculatura pulmonar, a possíveis intervenções e/ou terapêuticas sem potenciais fatores de confusão, como entrada neuronal e hormonal ou alteração hemodinâmica in vivo. Ao mesmo tempo, eles mantêm a interação fisiológica de ventilação e perfusão, em contraste com as condições in vitro. Uma proposta que analisa as respostas imunes nos pulmões⁵, por exemplo, precisa da mesma qualidade de dados que um estudo focado em aumentar o tamanho do pool de doadores⁶ para transplantes de pulmão. A EVLP pode ser usada em uma variedade de espécies, incluindo camundongos³, ^ratos 7,8,9,10,11,12, porcos 13 e humanos 2. Portanto, é necessário estabelecer um modelo que possa produzir dados confiáveis a partir de uma variedade de parâmetros experimentais diferentes. A relevância clínica será gerada em estudos subsequentes usando o modelo EVLP como ferramenta.

Embora as configurações comerciais estejam disponíveis para compra para a maioria das espécies, elas geralmente podem ter um custo proibitivo e confinar os pesquisadores a uma marca específica de equipamento e software proprietário. Qualquer desvio da configuração pronta para uso (por exemplo, ir de uma espécie para outra) requer previsão e trabalho em torno da configuração fornecida, o que pode ser difícil ou impossível. A seguir, uma configuração DIY (faça você mesmo) para pulmões isolados de ratos que é modular e econômica, bem como o procedimento cirúrgico para isolar os pulmões, são descritos.

Protocol

A parte in vivo dos experimentos (da anestesia geral à eutanásia) requer aprovação prévia do respectivo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados (número de protocolo M1700168) pela IACUC no Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee, e foram realizados em conformidade com as diretrizes ARRIVE14. Antes da experimentação, todos os ratos foram alojados nas instalações de cuidados com animais do…

Representative Results

Após 10 min de estabilização e leituras basais, randomizamos um primeiro conjunto de 10 ratos Sprague Dawley machos em cinco pequenos grupos: isquemia global sem fluxo por 5, 7,5, 8, 9 ou 10 min (n = 2 por grupo) seguida de reperfusão; Esses experimentos preliminares limitados de determinação de dose foram conduzidos para identificar o maior tempo de isquemia possível para ainda permitir ventilação e reperfusão suficientes antes do eventual desenvolvimento de um aumento precipitado e irreversível na pressão d…

Discussion

Mais de 100 experimentos foram realizados com sucesso em nosso laboratório usando essa configuração. O design modular desta configuração personalizada deu grande flexibilidade a possíveis mudanças nos requisitos experimentais. Enquanto outras configurações utilizam um desoxigenador¹⁸ para imitar o consumo constante de oxigênio e a produção de CO₂ pelos órgãos-alvo, esse modelo simplificado não empregou esse recurso, devido ao foco no estudo dos efeitos de diferentes compo…

Materials

1,000 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
1,500 mL Glass Beaker	Pyrex, Chicago, IL
Air Trap Compliance Chamber	Radnoti	130149
Bioamplifiers	CWE Inc	BPM-832
Clamps	Fisher Scientific	S02626
DAQ (Data Acquisition)	National Instruments, Austin, TX	NI USB-6343
Gas Mixer	CWE Inc, Ardmore, PA	GSM-4
Heating Coil	Radnoti, Covina, CA	158822
Heating Plate	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	11-100-49SH
Heparin	Pfizer	W63422
LabVIEW Full Development System 2014	National Instruments
Pentobarbital	Diamondback Drugs	G2270-0235-50
pH700 Probe	OAKTON, Vernon Hills, IL	EW-35419-10
Polystat Water Bath	Cole-Parmer	EW-12121-02
Rodent Ventilator	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Model 683
Roller Pump	Cole-Parmer, Wertheim, Germany	Ismatec REGLO Digital MS 2/8
Sprague Dawley Rat	Charles River, Wilmington, MA	Strain code 001
VetScan i-STAT	Abraxis, Chicago, IL	i-STAT 1