본 프로토콜은 유동 세포분석 또는 분광형광계를 사용하여 형광 기질을 통해 카스파아제 활성을 측정하는 두 가지 방법을 설명합니다.
카스파아제로 알려진 시스테인 프로테아제의 활성화는 여러 형태의 세포 사멸에서 중요한 과정으로 남아 있습니다. Caspases는 프로그램 된 세포 사멸의 가장 많이 연구 된 형태 인 세포 사멸의 중요한 개시 자이자 집행 자입니다. 세포 사멸은 발달 과정에서 발생하며 조직 항상성에서 필요한 사건입니다. Pyroptosis는 카스파제를 이용하는 또 다른 형태의 세포 사멸이며 인플라마좀의 활성화를 통해 면역 체계를 활성화하는 중요한 과정으로, 인터루킨-1(IL-1) 계열의 구성원을 방출합니다. 카스파아제 활성을 평가하기 위해, 표적 기질을 평가할 수 있다. 그러나 민감도는 단일 세포 또는 낮은 수준의 활동을 검사할 때 문제가 될 수 있습니다. 우리는 형광 기질이 유세포 분석에 의한 인구 기반 분석 또는 단일 세포 분석과 함께 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 적절한 대조군을 사용하면 다른 아미노산 서열을 사용하여 어떤 카스파제가 활성인지 확인할 수 있습니다. 이들 분석을 사용하여, 종양 괴사 인자 (TNF) 자극시 세포 사멸 단백질의 억제제의 동시 손실이 확인되었으며, 이는 주로 다른 형태의 세포 사멸보다는 대 식세포에서 세포 사멸을 유도한다.
Caspases는 여러 형태의 프로그램 된 세포 사멸에 관여합니다. 세포 사멸은 프로그램 된 세포 사멸의 가장 많이 연구 된 형태이며 카스파 아제 활성1과 관련이 있습니다. 모든 카스파제는 크고 작은 촉매 서브 유닛을 가지고 있습니다. 카스파제-1, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-9 및 카스파제-11은 카스파아제 활성화 및 모집 도메인(CARD)을 보유하고, 카스파제-8 및 카스파제-10은 사멸 효과기 도메인(DED)2,3,4,5를 함유한다(표 1). 세포 사멸은 두 가지 주요 경로, 즉 외적 경로와 내인성 경로에 의해 시작될 수 있습니다. 외인성 세포 사멸 경로는 종양 괴사 인자 수퍼 패밀리 (TNFSF)의 일부인 사망 수용체에 의해 유발됩니다. 사멸 수용체는 DED 도메인을 보유하여 카스파제 -8 활성을 촉진합니다6. 내인성 세포 사멸 경로는 세포 사멸 형성 후 카스파 제 -9의 활성화를 포함하며, 시토크롬 c 및 Apaf-17의 방출을 필요로한다. 개시제 카스파제, 카스파제-8 또는 카스파제-9의 활성화는 카스파제-3, 카스파제-6 및 카스파제-7인 사형집행인 카스파제의 절단 및 후속 활성화를 유도한다. 사형 집행 인 카스파 아제가 활성화되어 있음을 확인하는 것은 세포가 세포 사멸을 겪고 있음을 나타내며,이 활성화는 세포 사멸 모드를 정의하는 중요한 요소로 간주됩니다.
카스파제 활성화는 또한 염증을 조절하고 대체 형태의 프로그램된 세포 사멸을 유도하는 중요한 분기점입니다. 예를 들어, 카스파제 -1 활성화는 인터루킨 -1 패밀리8의 전 염증성 사이토 카인의 성숙을 유도한다. 이 패밀리로부터의 사이토카인, 특히 IL-1β 및 IL-18의 방출 및 활성화는 원형질막 9,10에서의 가스더민 D 절단 및 기공 형성으로부터 발생한다. gasdermin D 기공의 부적절한 막 복구는 pyroptosis11로 알려진 일종의 세포 사멸을 초래할 수 있습니다. 더욱이, 카스파제-8 활성은 괴사(necroptosis)12로 알려진 카스파제-비의존적 세포 사멸의 억제를 초래한다. 수용체 상호작용 세린/트레오닌 단백질 키나아제 1(RIPK1)은 괴사증 및 NF-kB에 의해 조절되는 염증을 유발하는 데 중요한 요소 중 하나입니다. 모델은 RIPK1이 카스파제-8에 의해 절단되어 NF-kB 신호전달, 세포자멸사 및 괴사증13,14를 제한하는 것으로 나타났습니다. 따라서 다양한 카스파제의 활성을 확인하면 결과 염증 및 세포 사멸 양식을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
세포 사멸 양식을 조절하는 카스파제의 기능과는 별개로, 카스파아제 활성은 또한 감염15,16에 반응하여 인터페론 (IFN)과 같은 다른 사이토카인 패밀리를 조절할 수 있다. 또한 카스파제는 세포 운명 결정, 조직 복구 및 재생, DNA 복구를 통한 종양 발생 및 신경 시냅스 기능을 포함한 비 세포 사멸 기능에 관여합니다. 이러한 치명적이지 않은 역할에서 카스파제의 활성은 세포 국소화 및 카스파제의 양에 의해 제한되는 것으로 생각됩니다. 따라서, 카스파아제 활성의 수준을 정량화하는 것은 세포가 세포 사멸을 겪는지 또는 카스파아제가 비-세포 사멸 기능에서 역할을 하는지 여부를 잘 정의할 수 있다(4,17,18).
카스파제 활성은 여러 가지 방법으로 평가할 수 있습니다. 절단된 카스파제 및 그 기질에 대한 웨스턴 블로팅이 활성의 지표로 사용되었지만 이러한 분석은 기껏해야 정성적입니다. 카스파아제 활성이 세포 사멸과 관련이 있는지 여부를 결정하기 위해서는 정량적 측정이 이상적입니다. 카스파제는 4 개의 아미노산으로 구성된 인식 부위에서 기질을 절단하기 때문에 비색, 발광 또는 형광 측정 방법이 개발되었습니다. 그러나, 카스파제는 그들의 기질 인식(19,20)에서 가소성을 갖는 것으로 보인다. 인식 서열은 단백질 도메인과 연관되지 않는다(표 1). 그러나 테트라펩타이드 서열 DEVD는 카스파제-3 및 카스파제-7 활성20,21을 검출하는데 사용될 수 있다.
Smac 모방체는 아폽토시스 단백질 (IAP)의 억제제를 표적으로 하는 화합물이다. 암세포의 하위세트에서 Smac 모방체의 사용은 세포가 TNF-유도된 세포 사멸에 민감해지게 한다(22). 1차 대식세포에서, Smac 모방체는 TNF23,24의 외인성 첨가 없이 세포 사멸을 유발한다. Smac 모방체-유도된 분해에 의한 cIAP1의 손실은 TNF의 생산을 초래한다. 카스파아제 활성이 검출되면 세포가 괴사에 의해 죽지 않고 사멸 방식으로 죽었다는 것을 의미합니다. 이 방법에서, 절단된 DEVD 기질의 검출은 카스파제-3/카스파제-7 활성을 확인하는 데 사용된다. 세포 사멸을 확인하기 위한 추가 실험은이전에 24일에 발표되었습니다.
이 방법에서, 플루오로 생성 기질은 카스파제 -3 / 카스파 제 -7 활성을 측정하기 위해 집단 기반 분석 또는 단일 세포 분석에 사용됩니다. 두 방법 모두 기질의 절단에 기초한 정량적 방식으로 카스파제 활성을 측정한다. 한 가지 장점은 수많은 샘플에 이러한 방법을 활용할 수 있다는 것입니다. 이들 방법에 의해, 카스파제-3/카스파제-7 활성은 Smac 모방체로 처리된 1차 대식세포에서 검출된다.
인구 기반 형광 분석의 중요한 측면은 용해에서 형광 판독까지의 시간입니다. 샘플은 절차 내내, 특히 분석을 “판독”하기 전에 얼음 위에 보관해야 합니다. 이것은 기질의 조기 절단 및 형광을 방지합니다. 모집단 기반 분석을 사용하면 최적화가 덜 필요할 수 있습니다. 분석에 사용되는 단백질의 양이 정규화되어 샘플을 직접 비교할 수 있습니다. 한 가지주의 할 점은 세포 사멸의 후기 단계에서 총 단백질 양이 감소한다는 것입니다. 따라서, 카스파제 활성의 검출이 불가능할 수 있다. 이 문제를 피하기 위해 다른 동역학 또는 다른 치료 용량이 권장됩니다. 또한, 다른 소프트웨어를 사용하여 이 방법에 설명된 소프트웨어 외에 카스파제 활성의 속도를 정확하게 평가할 수 있습니다.
유세포 분석 분석의 경우, 집단을 자신있게 게이트하기에 충분한 이벤트 또는 세포가 필요합니다. 또한, 유동 기반 분석에서 더 많은 최적화가 세포 수에 대한 기질의 최적 비율을 달성하기 위해 요구될 수 있다. 그러나 유세포분석을 사용하면 이 방법은 세포 유형 식별을 위한 세포 표면 마커와 같은 추가 파라미터를 측정하는 데 적합합니다.
집단 및 단일 세포 방법 모두 다른 카스파제에 사용할 수 있습니다. 그러나 인식 시퀀스는 다른 카스파제에 대해 덜 차별된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서, 카스파제 활성을 위한 다른 방법들이 사용되어야 한다. 여기에는 카스파제 활성의 억제, 특정 카스파제의 CRISPR 또는 녹다운, 및 알려진 기질의 절단을 검출하기 위한 웨스턴 블로팅이 포함됩니다.
카스파제 활성을 검출하기 위한 하나의 대안적인 방법은 타임랩스 이미징이다. 동일한 투과성 카스파제 기질을 아넥신 V와 같은 다른 생존 마커와 함께 사용하여 세포 사멸의 동역학에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 이미징은 또한 카스파아제 활성과 세포 생존을 분리하여 세포 집단에서 치사량의 카스파아제 활성을 검출할 수 있습니다. 카스파제-3/카스파제-7의 비-살상 기능은 선천성 면역 세포(29)에서의 항바이러스 조절, 특히 미토콘드리아 DNA 방출(15,16)을 통한 I형 IFN의 활성화와 관련된다. 따라서, 카스파제 활성을 측정하기 위한 이들 분석은 세포 사멸의 상이한 모드를 확인하는데 중요하며, 비-세포 사멸 기능을 평가하는데 유용할 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
WWW는 Clöetta Medical Research Fellow 보조금, S.R.은 CanDoc UZH Forschungskredit, J.T.는 중국 장학금 위원회의 지원을 받습니다.
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |