Denne protokollen beskriver to metoder for å måle kaspaseaktivitet gjennom et fluorogent substrat ved hjelp av flowcytometri eller et spektrofluorometer.
Aktiveringen av cysteinproteaser, kjent som caspaser, forblir en viktig prosess i flere former for celledød. Kaspaser er kritiske initiatorer og bødler av apoptose, den mest studerte formen for programmert celledød. Apoptose oppstår under utviklingsprosesser og er en nødvendig hendelse i vevshomeostase. Pyroptose er en annen form for celledød som benytter caspases og er en kritisk prosess for å aktivere immunsystemet gjennom aktivering av inflammasomet, noe som resulterer i frigjøring av medlemmer av interleukin-1 (IL-1) familien. For å vurdere caspaseaktivitet kan målsubstrater vurderes. Imidlertid kan følsomhet være et problem når man undersøker enkeltceller eller aktivitet på lavt nivå. Vi demonstrerer hvordan et fluorogent substrat kan brukes med en populasjonsbasert analyse eller encelleanalyse ved flowcytometri. Med riktige kontroller kan forskjellige aminosyresekvenser brukes til å identifisere hvilke caspaser som er aktive. Ved hjelp av disse analysene er samtidig tap av inhibitorer av apoptoseproteiner ved tumornekrosefaktor (TNF) stimulering identifisert, noe som primært induserer apoptose i makrofager snarere enn andre former for celledød.
Kaspaser er involvert i flere former for programmert celledød. Apoptose er den mest studerte formen for programmert celledød og er assosiert med caspaseaktivitet1. Alle caspaser har en stor og liten katalytisk underenhet. Caspase-1, caspase-4, caspase-5, caspase-9 og caspase-11 har et caspase aktiverings- og rekrutteringsdomene (CARD), og caspase-8 og caspase-10 inneholder dødseffektordomener (DED) 2,3,4,5 (tabell 1). Apoptose kan initieres av to hovedveier: den ekstrinsiske banen og den indre banen. Den ytre apoptotiske banen utløses av dødsreseptorer, som er en del av tumornekrosefaktor-superfamilien (TNFSF). Dødsreseptorer har DED-domener, noe som letter caspase-8-aktivitet6. Den indre apoptotiske banen involverer aktivering av caspase-9 etter dannelsen av apoptosomet, som krever frigjøring av cytokrom c og Apaf-17. Aktiveringen av enten initiator caspase, caspase-8 eller caspase-9, fører til spaltning og påfølgende aktivering av bøddelcaspasene, som er caspase-3, caspase-6 og caspase-7. Identifisering av at bøddelkaspasene er aktive, indikerer at cellene gjennomgår apoptose, og denne aktiveringen anses som en viktig faktor for å definere modusen for celledød.
Kaspaseaktivering er også et kritisk tidspunkt for regulering av betennelse og induksjon av alternative former for programmert celledød. For eksempel fører caspase-1-aktivering til modning av proinflammatoriske cytokiner i interleukin-1-familien8. Frigjøring og aktivering av cytokiner fra denne familien, spesielt IL-1β og IL-18, skyldes gasdermin D-spaltning og poredannelse ved plasmamembranen 9,10. Utilstrekkelig membranreparasjon av gasdermin D-porer kan resultere i en type celledød kjent som pyroptose11. Videre resulterer caspase-8-aktivitet i inhibering av en caspase-uavhengig celledød kjent som nekroptose12. Reseptorinteragerende serin/treoninproteinkinase 1 (RIPK1) er en av de kritiske faktorene ved nekroptose og for å drive betennelse regulert av NF-kB. Modeller har vist at RIPK1 spaltes av caspase-8, noe som resulterer i begrensende NF-kB-signalering, apoptose og nekroptose13,14. Derfor kan identifisering av aktiviteten til forskjellige caspaser hjelpe til med å forstå den resulterende betennelsen og celledødsmodaliteten.
Uavhengig av funksjonen til caspaser i regulering av celledødsmodaliteter, kan caspaseaktivitet også regulere andre cytokinfamilier, som interferon (IFN), som respons på infeksjon15,16. I tillegg er caspaser involvert i ikke-celledødsfunksjoner, inkludert celleskjebnebeslutninger, vevsreparasjon og regenerering, tumorigenese gjennom DNA-reparasjon og neuronal synapsefunksjon. Aktiviteten til caspaser i disse ikke-dødelige rollene antas å være begrenset av den cellulære lokaliseringen og mengden caspaser. Derfor kan kvantifisering av nivået av caspaseaktivitet godt definere om en celle gjennomgår celledød eller om caspasen spiller en rolle i en ikke-celledødsfunksjon 4,17,18.
Kaspaseaktivitet kan vurderes ved flere metoder. Western blotting for spaltet caspases og deres substrater har blitt brukt som en indikator på aktivitet, men disse analysene er i beste fall kvalitative. For å avgjøre om caspaseaktivitet er assosiert med celledød, er en kvantitativ måling ideell. Siden caspaser spalter substrater på et anerkjennelsessted bestående av fire aminosyrer, har kolorimetriske, luminescens eller fluorometriske metoder blitt utviklet. Kaspaser ser imidlertid ut til å ha plastisitet i substratgjenkjenningen 19,20. Gjenkjenningssekvensen er ikke assosiert med proteindomenene (tab 1). Tetrapeptidsekvensen DEVD kan imidlertid brukes til å detektere caspase-3- og caspase-7-aktivitet20,21.
Smac-mimetikk er forbindelser rettet mot inhibitorer av apoptoseproteiner (IAP). Bruken av Smac-mimetikk i en delmengde av kreftceller fører til at cellene blir følsomme for TNF-indusert celledød22. I primære makrofager forårsaker Smac-mimetikk celledød uten eksogen tilsetning av TNF23,24. Tapet av cIAP1 ved Smac mimetisk-indusert nedbrytning resulterer i produksjon av TNF. Hvis caspaseaktivitet oppdages, betyr dette at cellene ikke døde av nekroptose, men på en apoptotisk måte. I denne metoden brukes deteksjon av spaltet DEVD-substrat for å identifisere caspase-3/caspase-7-aktivitet. Videre eksperimenter for å bekrefte apoptotisk celledød er publisert tidligere24.
I denne metoden brukes et fluorogent substrat i en populasjonsbasert analyse eller enkeltcelleanalyse for å måle caspase-3 / caspase-7-aktivitet. Begge metodene måler caspaseaktiviteten på en kvantitativ måte basert på spaltningen av et substrat. En fordel er muligheten til å bruke disse metodene for mange prøver. Med disse metodene påvises caspase-3/caspase-7-aktivitet i primære makrofager behandlet med Smac-mimetika.
Et kritisk aspekt ved den populasjonsbaserte fluorometriske analysen er tiden fra lysis til avlesning av fluorescensen. Prøvene må holdes på is gjennom hele prosedyren, spesielt før “lesing” av analysen. Dette forhindrer for tidlig spaltning og fluorescens av substratet. Ved bruk av populasjonsbasert analyse kan det være nødvendig med mindre optimalisering. Mengden protein som brukes i analysen er normalisert, slik at prøvene kan sammenlignes direkte. En advarsel er at på et sent stadium av apoptotisk celledød reduseres den totale proteinmengden; Derfor kan det hende at påvisning av caspaseaktivitet ikke er mulig. Ulike kinetikk eller forskjellige behandlingsdoser anbefales for å omgå dette problemet. I tillegg kan annen programvare brukes til å nøyaktig vurdere frekvensen av caspase aktivitet i tillegg til programvaren beskrevet i denne metoden.
For den flowcytometriske analysen kreves det nok hendelser eller celler til å sikre populasjonene trygt. I tillegg kan det være nødvendig med mer optimalisering i den flytbaserte analysen for å oppnå det optimale forholdet mellom substrat og cellenummer. Men med flowcytometri egner denne metoden seg til å måle flere parametere, for eksempel celleoverflatemarkører for celletypeidentifikasjon.
Både populasjons- og encellemetodene kunne brukes til andre caspaser. Det er imidlertid viktig å huske at gjenkjenningssekvensen er mindre diskriminert for andre caspaser. Som sådan må andre metoder for caspaseaktivitet brukes. Dette inkluderer inhibering av caspaseaktivitet, CRISPR eller nedslag av spesifikke caspaser og vestlig blotting for å oppdage spaltning av kjente substrater.
En alternativ metode for å oppdage caspaseaktivitet er time-lapse-avbildning. Det samme permeable caspase-substratet kan brukes sammen med andre markører for levedyktighet, for eksempel vedlegg V, for å gi informasjon om kinetikken til celledød. Avbildning vil også skille caspaseaktiviteten og celleoverlevelsen, noe som muliggjør påvisning av subletale mengder kaspaseaktivitet i en cellepopulasjon. De ikke-dødelige funksjonene til caspase-3/caspase-7 er knyttet til antiviral regulering i medfødte immunceller29, spesielt aktivering av type I IFN via mitokondriell DNA-frigjøring15,16. Dermed er disse analysene for å måle caspaseaktivitet kritiske for å identifisere forskjellige moduser for celledød og kan være nyttige for å vurdere ikke-celledødsfunksjoner.
The authors have nothing to disclose.
W.W.W. støttes av Clöetta Medical Research Fellow grant, S.R. støttes av CanDoc UZH Forschungskredit, og J.T. støttes av Chinese Scholarship Council.
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |