本协议描述了两种使用流式细胞术或分光荧光计通过荧光底物测量半胱天冬酶活性的方法。
半胱氨酸蛋白酶的活化,称为半胱天冬酶,仍然是多种形式的细胞死亡的重要过程。半胱天冬酶是细胞凋亡的关键启动剂和刽子手,细胞凋亡是研究最多的程序性细胞死亡形式。细胞凋亡发生在发育过程中,是组织稳态的必要事件。焦亡是利用半胱天冬酶的另一种细胞死亡形式,是通过激活炎症小体激活免疫系统的关键过程,导致白细胞介素-1(IL-1)家族成员的释放。为了评估半胱天冬酶活性,可以评估目标底物。然而,在检查单个细胞或低水平活性时,灵敏度可能是一个问题。我们展示了荧光底物如何与基于群体的测定或通过流式细胞术进行单细胞测定一起使用。通过适当的控制,可以使用不同的氨基酸序列来识别哪些半胱天冬酶是活跃的。使用这些测定,已经确定了肿瘤坏死因子(TNF)刺激时凋亡蛋白抑制剂的同时丢失,这主要诱导巨噬细胞凋亡而不是其他形式的细胞死亡。
半胱天冬酶参与几种形式的程序性细胞死亡。细胞凋亡是研究最多的程序性细胞死亡形式,与半胱天冬酶活性1有关。所有半胱天冬酶都有一个大大小小的催化亚基。半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-11具有半胱天冬酶活化和募集结构域(CARD),半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10含有死亡效应结构域(DED)2,3,4,5(表1)。细胞凋亡可以通过两种主要途径启动:外在途径和内在途径。外在凋亡途径由死亡受体触发,死亡受体是肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)的一部分。死亡受体具有DED结构域,促进半胱天冬酶-8活性6。内在凋亡途径涉及细胞凋亡形成后半胱天冬酶-9的激活,需要释放细胞色素c和Apaf-17。引发剂半胱天冬酶,半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-9的激活导致刽子手半胱天冬酶的切割和随后的激活,即半胱天冬酶-3,半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-7。确定刽子手半胱天冬酶是活跃的表明细胞正在经历细胞凋亡,这种激活被认为是定义细胞死亡模式的重要因素。
半胱天冬酶活化也是调节炎症和诱导程序性细胞死亡替代形式的关键时刻。例如,半胱天冬酶-1活化导致白细胞介素-1家族8的促炎细胞因子的成熟。该家族细胞因子的释放和活化,特别是IL-1β和IL-18,是由质膜9,10处的加斯皮明D切割和孔形成引起的。胃皮素D孔的膜修复不足可导致一种称为焦亡11的细胞死亡。此外,半胱天冬酶-8活性导致半胱天冬酶非依赖性细胞死亡的抑制,称为坏死性凋亡12。受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(RIPK1)是坏死性凋亡和驱动NF-kB调节的炎症的关键因素之一。 模型显示,RIPK1被半胱天冬酶-8切割,导致限制NF-kB信号传导,细胞凋亡和坏死性凋亡13,14。因此,鉴定不同半胱天冬酶的活性有助于了解由此产生的炎症和细胞死亡方式。
与半胱天冬酶调节细胞死亡模式的功能无关,半胱天冬酶活性还可以调节其他细胞因子家族,如干扰素(IFN),以响应感染15,16。此外,半胱天冬酶参与非细胞死亡功能,包括细胞命运决定、组织修复和再生、通过 DNA 修复的肿瘤发生和神经元突触功能。半胱天冬酶在这些非致死性作用中的活性被认为受到细胞定位和半胱天冬酶数量的限制。因此,量化半胱天冬酶活性水平可以很好地定义细胞是否经历细胞死亡或半胱天冬酶是否在非细胞死亡功能中发挥作用4,17,18。
半胱天冬酶活性可以通过多种方法评估。裂解半胱天冬酶及其底物的蛋白质印迹已被用作活性指标,但这些测定充其量是定性的。为了确定半胱天冬酶活性是否与细胞死亡有关,定量测量是理想的。由于半胱天冬酶在由四个氨基酸组成的识别位点切割底物,因此已经开发了比色法、发光法或荧光法。然而,半胱天冬酶在其底物识别中似乎具有可塑性19,20。识别序列与蛋白质结构域无关(表1)。然而,四肽序列DEVD可用于检测半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7活性20,21。
Smac模拟物是靶向细胞凋亡蛋白(IAP)抑制剂的化合物。在癌细胞子集中使用Smac模拟物会导致细胞对TNF诱导的细胞死亡变得敏感22。在原代巨噬细胞中,Smac模拟物在没有外源性添加TNF23,24的情况下引起细胞死亡。Smac模拟诱导的降解导致cIAP1的损失导致TNF的产生。如果检测到半胱天冬酶活性,这意味着细胞不是通过坏死性凋亡而死亡,而是以凋亡的方式死亡。在该方法中,切割的DEVD底物的检测用于鉴定半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7活性。确认凋亡细胞死亡的进一步实验已在24之前发表。
在该方法中,荧光底物用于基于群体的测定或单细胞分析以测量半胱天冬酶-3 / 半胱天冬酶-7活性。两种方法都基于底物的裂解以定量方式测量半胱天冬酶活性。一个优点是能够将这些方法用于大量样品。使用这些方法,在用Smac模拟物处理的原代巨噬细胞中检测到半胱天冬酶-3 / caspase-7活性。
基于群体的荧光测定的一个关键方面是从裂解到读取荧光的时间。在整个过程中,样品必须保持在冰上,特别是在“读取”测定之前。这可以防止底物过早裂解和荧光。使用基于群体的测定,可能需要较少的优化。测定中使用的蛋白质量被标准化,允许直接比较样品。需要注意的是,在凋亡细胞死亡的晚期,总蛋白质量减少;因此,可能无法检测半胱天冬酶活性。建议使用不同的动力学或不同的治疗剂量来规避这个问题。此外,除了该方法中描述的软件之外,其他软件可用于准确评估半胱天冬酶活性的速率。
对于流式细胞术测定,需要足够的事件或细胞来自信地浇灌群体。此外,可能需要对基于流动的测定进行更多优化,以实现底物与细胞数的最佳比例。然而,使用流式细胞术,该方法有助于测量其他参数,例如用于细胞类型鉴定的细胞表面标志物。
群体和单细胞方法都可用于其他半胱天冬酶。然而,重要的是要记住,识别序列对其他半胱天冬酶的区分较少。因此,必须使用其他半胱天冬酶活性方法。这包括抑制半胱天冬酶活性,CRISPR或敲低特定半胱天冬酶,以及蛋白质印迹以检测已知底物的裂解。
检测半胱天冬酶活性的一种替代方法是延时成像。相同的可渗透半胱天冬酶底物可以与其他活力标志物(如膜联蛋白V)一起使用,以提供有关细胞死亡动力学的信息。成像还可以分离半胱天冬酶活性和细胞存活,从而可以检测细胞群中亚致死量的半胱天冬酶活性。半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7的非致死功能与先天免疫细胞29中的抗病毒调节有关,特别是通过线粒体DNA释放15,16激活I型IFN。因此,这些测量半胱天冬酶活性的测定对于识别不同的细胞死亡模式至关重要,并且可能有助于评估非细胞死亡功能。
The authors have nothing to disclose.
W.W.W.由Clöetta医学研究员资助,S.R.由CanDoc UZH Forschungskredit支持,J.T.由中国国家留学基金委支持。
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |