近接ライゲーションアッセイによるER-ミトコンドリア接触部位における内因性オルガネラ内タンパク質相互作用の可視化と定量
Summary
膜接触部位(MCS)を研究するための新しいアプローチの必要性は、これらの細胞構造とその構成要素の研究への関心の高まりにより高まっています。ここでは、MCSに存在するオルガネラ内およびオルガネラ間タンパク質複合体を同定および定量するために、以前に利用可能であった顕微鏡技術を統合したプロトコルを紹介します。
Abstract
膜接触部位(MCS)は、膜融合を伴うことなく、並置された細胞小器官間の多様な生体分子(すなわち、カルシウムおよび脂質)の動的交換を可能にし、調節する、膜が近接する領域である。MCSは細胞の恒常性維持に不可欠であり、その機能は多量体タンパク質複合体として存在することが多い常在成分によって保証されています。MCSは、脂質合成と細胞カルシウム貯蔵の主要な部位である小胞体(ER)に関与することが多く、古典的な小胞体輸送経路から除外されているミトコンドリアなどの細胞小器官にとって特に重要です。ここ数年、ERとミトコンドリアの間のMCSは、その機能が細胞の代謝/生体エネルギーに強く影響するため、広く研究されてきました。これらの接触部位では、膜テザー、カルシウムチャネル、脂質移動タンパク質など、いくつかのタンパク質が同定され始めており、これらのMCS成分を研究するための新しい方法論と技術的アプローチの必要性が高まっています。ここでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)、ミトコンドリア染色、3Dイメージングセグメンテーションなど、互いに物理的に近く(>40 nm)、ER-ミトコンドリアMCSの同じ膜上に存在するタンパク質の検出を可能にする、組み合わせた技術的アプローチで構成されるプロトコルについて説明します。例えば、ERミトコンドリアと小胞体原形質膜MCSで相互作用し、局在することが以前に示されている2つのERアンカー脂質伝達タンパク質、ORP5とORP8を使用しました。ORP5-ORP8 PLAを細胞イメージングソフトウェア解析と関連付けることにより、ORP5-ORP8複合体のミトコンドリア表面からの距離を推定し、ORP5-ORP8 PLA相互作用の約50%がミトコンドリアに近接する小胞体サブドメインで発生していると判断することができました。
Introduction
オルガネラ間コミュニケーションは真核細胞の決定的な特徴です。オルガネラが通信する1つの方法は、テザー、脂質移動タンパク質、カルシウムチャネルなどの構造的および機能的タンパク質によって維持される2つのオルガネラ間の密接な膜対抗である膜接触部位(MCS)を形成することです1。MCSは、類似または異なる細胞小器官間で確立することができ、それらは細胞の恒常性を維持するために重要な細胞成分の交換を媒介する。現在までに、小胞体(ER)-ミトコンドリア、小胞体-原形質膜(PM)、および小胞体-脂肪滴(LD)接触を含むいくつかのMCSが同定されています1。その中で、ERとミトコンドリアの間に形成されるもの(MERCS)は、脂質やカルシウムの恒常性を含むいくつかの細胞機能の調節に関与しているため、最も研究されています2。ミトコンドリアは古典的な小胞輸送経路からほとんど除外されているため、ERから主要な脂質または脂質前駆体を輸入するために、MERCSとその分子成分に依存しています。MERCSを介したこれらの脂質の非小胞輸送は、適切なミトコンドリア脂質組成の維持、ならびにそれらの機能的および構造的完全性を保証します3。
さまざまな細胞機能へのMCSの重要な関与を考えると、それらの分子成分のより深い理解を提供することへの関心は、ここ数年で大幅に増加しています。MCSに関する知識を深めるために、いくつかのタイプのイメージングベースのアプローチが使用されてきました。その中でも、蛍光プローブベースの近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、内因性レベル4でオルガネラ間タンパク質間相互作用(検出範囲40 nm)を検出することにより、MCSの存在量の指標として広く使用されています。例えば、MERCSは、VDAC1-IP3R、GRP75-IP3R、CypD-IP3、およびPTPIP51-VAPB 5,6,7,8を含むいくつかのミトコンドリア-ERタンパク質ペア間のPLAを使用して視覚化および定量化されています。この技術は、MCS 5,7,9,10,11に存在するオルガネラ間タンパク質間相互作用の検出と定量に使用されていますが、ほとんどの研究ではPLAとオルガネラ染色が組み合わされていませんでした。その結果、PLA相互作用と関連するオルガネラとの近接性の測定を可能にする定量的方法はまだ開発されていません。したがって、これまでのところ、ERタンパク質の場合、他の細胞小器官と接触している膜サブドメイン内でのそれらの相互作用は、広く分布したERネットワーク内でのそれらの相互作用と区別されていませんでした。
ここでは、同じオルガネラの膜に存在するタンパク質間のPLA相互作用を検出し、MCSでパートナーオルガネラの膜への近接を分析するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、2つの前提に基づいて開発されました:1)過剰発現条件下で、ER脂質転移タンパク質ORP5およびORP8がER-ミトコンドリアおよびER-PM MCSで共局在および相互作用することを示す以前の研究12,13,14,15およびORP5がER-LD接触で局在すること16,17;2)PLA、共焦点顕微鏡、オルガネラ標識、3Dイメージング分析などの既存技術。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、MCS、特にMERCSにおけるオルガネラ間タンパク質PLA相互作用を同定および定量するために設計されました。このプロトコルの目新しさは、PLAと複数の細胞小器官の標識、共焦点顕微鏡、および3D画像分析を組み合わせて、同じ膜(この場合はミトコンドリア膜(MAM)またはMAMとLDに近接するER膜内)に存在する2つのタンパク質間のPLA相互作用を局在化および定量化することです。こ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD)、ATIP-Avenir Program、Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548)、Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527)、I’Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope、ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging;ANR-11-IDEX-0003-02/サクレー植物科学)。
Materials
| 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | VWR | 21236.291 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Circular glass coverslips 13mm no. 1.5 | Agar Scientific | L46R13-15 | |
| CMXRos red MitoTracker | Invitrogen | M7512 | red mitochondrial marker |
| Confocal inverted microscope SP8-X | Leica | DMI 6000 | |
| Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates | Merck | CLS3526 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92002 | |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma | DUO92004 | |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma | DUO92014 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 51985026 | serum free medium |
| Imaris software v 9.3 | Bitplane | N/A | cell imaging software |
| Incubator UINCU-line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) | Knittel Glass | ||
| mouse anti-ORP8 | Santa Cruz | 134409 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| rabbit anti-ORP5 | Sigma | HAP038712 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free | Invitrogen | 10977-035 |
Referências
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