Sistema de detecção de vírus de DNA baseado em RPA-CRISPR/Cas12a-SPM e aprendizado profundo

Resumo

Apresentamos um protocolo que combina amplificação da polimerase recombinase com um sistema CRISPR/Cas12a para detecção de traços de vírus de DNA e constrói microscopia portátil para smartphone com uma classificação assistida por inteligência artificial para detecção de vírus de DNA no local de atendimento.

Resumo

Relatamos um sistema de detecção de vírus de DNA rápido, fácil de implementar, altamente sensível, específico de sequência e ponto de atendimento (POC), que combina amplificação da polimerase recombinase (RPA) e sistema CRISPR/Cas12a para detecção de vestígios de vírus de DNA. O DNA alvo é amplificado e reconhecido por RPA e CRISPR/Cas12a separadamente, o que desencadeia a atividade de clivagem colateral de Cas12a que cliva um repórter de DNA rotulado como fluoróforo-supressor e generaliza a fluorescência. Para detecção de POC, a microscopia portátil de smartphone é construída para tirar imagens fluorescentes. Além disso, modelos de deep learning para classificação binária de amostras positivas ou negativas, alcançando alta precisão, são implantados no sistema. O vírus 3 da rã (FV3, gênero Ranavirus, família Iridoviridae) foi testado como exemplo para este sistema de detecção de POC de vírus de DNA, e os limites de detecção (LoD) podem atingir 10 aM em 40 min. Sem operadores qualificados e instrumentos volumosos, a classificação portátil e em miniatura RPA-CRISPR/Cas12a-SPM com inteligência artificial (IA) mostra grande potencial para detecção de vírus de DNA POC e pode ajudar a prevenir a propagação de tais vírus.

Introdução

Nos últimos anos, epidemias de doenças infecciosas causadas por diferentes vírus têm ocorrido com frequência, incluindo a epidemia da doença do vírus Ebola (EVD) em 2014¹ e 2018², a Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS) em 2015³, a epidemia da doença do vírus Zika em 2015⁴, a doença do Coronavírus 2019 (COVID-19) causada pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2)⁵ e a continuação da varíola dos macacos causada pelo vírus da varíola dos macacos (MKPV) em 2022⁶. Esses surtos repentinos de doenças i....

Protocolo

1. Processamento de amostras

1. Veja o Frog Virus 3 (FV3, gênero Ranavirus, família Iridoviridae), um vírus de DNA de fita dupla. Selecione o gene do capsídeo principal (mcp) como alvo para a detecção de FV3, pois é altamente conservado e geralmente considerado como alvo para detecção de ranavírus. A sequência alvo selecionada é mostrada na Tabela 1.
   NOTA: O Frog Virus 3 é tomado como exemplo neste protocolo.
2. Para a preparação de fragmentos de DNA alvo, use fragmentos de DNA do gene mcp de FV3 e Vírus de Necrose Infecciosa do Baço e Rim (ISKNV, outro Ranavirus).
   NOTA: Neste es....

Resultados

Este método se concentra em um sistema de detecção rápido, fácil de implementar, altamente sensível e no local de atendimento (POC) para vírus de DNA. O design dos pares de primers para a reação RPA e o design do crRNA para a reação CRISPR/Cas12a são duas das partes essenciais, pois afetarão a eficiência da reação RPA-CRISPR/Cas12a e influenciarão a detecção e classificação subsequentes.

Neste método, o FV3 é considerado um exemplo de detecção de vírus de DNA. Alguns pare.......

Discussão

Nesse método, desenvolvemos um sistema de detecção de vírus de DNA POC rápido, fácil de implementar, altamente sensível, específico de sequência e POC com assistência de IA. Após a obtenção das amostras, o RPA é aplicado para amplificar a sequência alvo e, em seguida, o CRISPR/Cas12a pode reconhecer o DNA alvo e liberar fluorescência, o que amplia o sinal de detecção. A microscopia portátil de smartphone é construída para obter imagens de fluorescência, e modelos de aprendizado profundo com aprendizado de transferência s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
20x amplificação	OLYMPUS	OPLN20X
laser verde de 532 nm	Thorlabs	PL201	com potência de saída de 0,9 mW
de onda de corte de 535 nm	cromo	AT535
6x buffer de carregamento de DNA	Thermo scientific	R0611
Microplaca preta de 96 poços	Corning Incorporated	3603	Preto com fundo plano transparente
Lente asférica	Lubang	N / A
Filtro passa-banda	SEMROCK	FF01-542 / 27-25
Bsu DNA Polimerase	ATG Biotecnologia	M103	Grande
Fragmento crRNA	Sangon Biotech	N / A
Fragmentos de DNA	Sangon Biotech	N / A
Suportes dicróicos	Ruicage	N / A
Espelho dicróico	SEMROCK	FF555-Di03-25x36	com um comprimento de onda de corte de 535 nm
E.Z.N.A Kit de extração de gel	Omega Biotek	D2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)	New England Biolabs (Beijing) LTD	M0653T
Suportes de filtro	Ruicage	N/A
Fluorophore-ssDNA-Quencher sondas repórter	Sangon Biotech	N/A	TAMRA (carboxitetrametilrodamina) como fluoróforo nas 5 extremidades; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) como o supressor nas 3 extremidades
GP32	ATG Biotechnology	M104
ImageJ	Versão de código aberto	1.53t 24	Baixado de https://imagej.nih.gov/ij/
Leitor de microplacas	SPARK, TECAN	N/A
Multi-Block thermal Cycler Instrumento de PCR	LongGene	N/A
NanoDrop 2000/2000c Espectrofotômetros	Thermo Scientific	ND-2000
NEBuffer r2.1	New England Biolabs (Beijing) LTD	B6002S	10x CRISPR/Cas12a Tampão de reação
Tratamento de plasma de oxigênio	Eletro-Técnica  Produtos	N/A
Patógeno Inativar, Livre de extração de ácido nucleico, Tampão direto para PCR com Proteinase K (PINDBK)	Ebio	PINDBK -25mL
Pares de primers PCR	Sangon Biotech	N/A
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
RPA pares de primers	Sangon Biotech	N/A
Smartphone	Huawei	Mate10
Estágios de tradução	Ruicage	N/A
Filtros de densidade neutra transmitida	Thorlabs	ND40A
Lentes acromáticas triplas	Thorlabs	TRH127-020-A
UvsX	ATG Biotecnologia	M105
UvsY	ATG Biotecnologia	M106

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