생쥐에서 자가면역 당뇨병의 입양 이식 모델에서 이식편 생존의 생물발광 모니터링
Summary
이 프로토콜은 자발적 당뇨병 NOD 마우스에서 정제된 비장 세포로 도전받은 비만 당뇨병(NOD) 중증 복합 면역 결핍 마우스에서 NIT-1 세포를 이식하고 이미징하기 위한 간단하고 최소 침습적인 방법을 설명합니다.
Abstract
제 1 형 당뇨병은 췌장의 인슐린 생산 베타 세포의자가 면역 파괴를 특징으로합니다. 이 질병에 대한 유망한 치료법은 줄기 세포 유래 베타 세포의 이식입니다. 그러나 이식된 세포를 지속적인 자가면역으로부터 보호하기 위해 유전자 변형이 필요할 수 있습니다. 당뇨병 마우스 모델은 자가면역 공격으로부터 이식된 세포를 보호하기 위한 전략의 예비 평가에 유용한 도구입니다. 여기에 기술된 것은 마우스에서 당뇨병의 입양 이식 모델에서 세포 이식편을 이식하고 이미징하기 위한 최소 침습적 방법이다. 이 프로토콜에서, 반딧불이 루시페라아제 이식유전자 luc2 를 발현하는 쥐 췌장 베타 세포주 NIT-1의 세포를 면역결핍성 비비만 당뇨병(NOD)-중증 복합 면역결핍(scid) 마우스에 피하 이식합니다. 이 마우스는 자가면역을 전달하기 위해 자발적 당뇨병 NOD 마우스의 비장 세포를 동시에 정맥 주사합니다. 이식편은 세포 생존을 모니터링하기 위해 비침습적 생물발광 이미징을 통해 일정한 간격으로 이미지화됩니다. 돌연변이 세포의 생존은 동일한 마우스에 이식된 대조군 세포의 생존율과 비교됩니다.
Introduction
제1형 당뇨병(T1D)은 췌장의 인슐린 생산 베타 세포의 자가면역 파괴로 인해 발생합니다. 베타 세포 질량의 손실은 인슐린 결핍과 고혈당을 초래합니다. T1D 환자는 외인성 인슐린을 매일 여러 번 주사하고 평생 동안 심각한 고혈당증 및 저혈당증 에피소드를 경험합니다. 이러한 에피소드와 관련된 합병증으로는 당뇨병성 망막병증, 신장 기능 저하, 신경병증등이 있다 1.
인슐린 주사는 T1D의 치료법이지만 치료법은 아닙니다. 그러나 손실된 베타 세포 덩어리를 대체하면 환자가 자신의 인슐린을 생산할 수 있게 하여 질병을 역전시킬 수 있습니다. 그러나 사체기증자의 공급은 제한되어 있다2. 줄기 세포 유래 췌도(SC-islets)는 이식을 위한 베타 세포의 사실상 무제한 공급을 제공할 수 있다. 몇몇 그룹은 인간 배아 줄기 세포 (ESCs)와 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)가 기능적 베타 유사 세포를 생성하기 위해 분화 될 수 있음을 입증했다 3,4,5. 유망한 초기 임상 시험 데이터에 따르면 이 세포는 이식 후에도 기능을 유지하며 환자가 인슐린 의존성을 갖도록 할 수 있다6. 그러나 만성 면역 억제가 필요하므로 암과 감염에 대한 감수성이 증가합니다. 또한, 면역억제제는 장기적으로 이식편에 세포독성을 나타낼 수 있다7. 면역억제의 필요성을 없애기 위해, SC-섬은 이식 후 동종면역뿐만 아니라 재발성 자가면역으로부터 보호하기 위해 유전자 변형될 수 있다.
줄기 세포 연구는 비용과 노동력이 매우 까다롭습니다. 마우스 세포주 및 동물 모델은 이식된 세포를 자가면역으로부터 보호하기 위한 전략의 초기 식별 및 실험적 검증에 유용한 도구입니다. NOD 마우스는 인간 T1D8와 많은 유사성을 가진 자발성 자가면역 당뇨병을 앓고 있으며, NIT-1 인슐린종 세포주는 이 마우스 균주와 유전적 배경을 공유한다9. 당뇨병은 복제 실험 마우스에서 당뇨병의 발병을 시간적으로 동기화하기 위해 NOD 마우스로부터 당뇨병성 비장세포의 주입을 통해 관련 면역결핍 NOD-scid 마우스 균주에 입양적으로 전달될 수 있다10. 이 모델은 SC 섬에서 추가 검증을 위해 유전자 표적을 비교적 빠르고 저렴하게 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 최근에, 이 방법은 생체 내 자가면역으로부터 일차 인간 섬을 보호하고 시험관 내 베타 세포 스트레스로부터 iPSC 유래 섬을 보호하는 것으로 밝혀진 표적인 RNLS를 식별하고 검증하기 위해 적용되었습니다 11. 여기에 설명된 것은 유전자 조작된 NIT-1 세포를 이식하고 마우스에서 자가면역 당뇨병의 입양 이식 모델에서 이들의 생존을 비침습적으로 모니터링하는 간단한 프로토콜입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
T1D는 현재 치료법이 존재하지 않는 치명적인 질병입니다. 베타 세포 대체 요법은 이 질환을 앓고 있는 환자에게 유망한 치료법을 제공하지만 이 전략의 중요한 장벽은 이식된 베타 세포에 대한 반복적인 자가면역 공격의 가능성입니다. SC-베타 세포의 면역 가시성이나 감수성을 줄이기 위한 유전 공학은 이 문제에 대한 잠재적인 해결책 중 하나입니다. 여기에 기술된 것은 마우스에서 자가면역 당…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로토콜에 설명된 방법을 개발한 Erica P. Cai 박사와 Yuki Ishikawa 박사에게 감사드립니다(참조 11 참조). S.K.와 P.Y.의 실험실에서의 연구는 미국 국립보건원(NIH)(R01DK120445, P30DK036836), JDRF, 하버드 줄기세포 연구소 및 비트슨 재단의 보조금으로 지원됩니다. T.S.는 국립 당뇨병 및 소화기 및 신장 질환 연구소 (NIDDK) (T32 DK007260-45)의 박사후 연구원의 지원을 받았으며 K.B.는 Mary K. Iacocca Foundation의 펠로우 십에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
Referências
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