يصف هذا البروتوكول طريقة مباشرة وطفيفة التوغل لزرع وتصوير خلايا NIT-1 في الفئران المصابة بالسكري غير البدينة (NOD) التي تعاني من نقص المناعة الشديد والتي تم تحديها مع خلايا الطحال المنقاة من فئران NOD المصابة بالسكري تلقائيا.
يتميز مرض السكري من النوع 1 بتدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا المنتجة للأنسولين في البنكرياس. العلاج الواعد لهذا المرض هو زرع خلايا بيتا المشتقة من الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، قد تكون التعديلات الجينية ضرورية لحماية الخلايا المزروعة من المناعة الذاتية المستمرة. تعد نماذج الفئران المصابة بالسكري أداة مفيدة للتقييم الأولي لاستراتيجيات حماية الخلايا المزروعة من هجوم المناعة الذاتية. الموصوفة هنا هي طريقة طفيفة التوغل لزرع وتصوير الطعوم الخلوية في نموذج نقل بالتبني لمرض السكري في الفئران. في هذا البروتوكول ، يتم زرع خلايا من خط خلايا بيتا البنكرياس NIT-1 الذي يعبر عن اليراع luciferase transgene luc2 تحت الجلد في الفئران المصابة بنقص المناعة غير البدينة (NOD) – شديدة النقص المناعي المشترك (scid). يتم حقن هذه الفئران في وقت واحد عن طريق الوريد مع خلايا الطحال من الفئران NOD السكري تلقائيا لنقل المناعة الذاتية. يتم تصوير الطعوم على فترات منتظمة عبر التصوير الحيوي غير الجراحي لمراقبة بقاء الخلية. تتم مقارنة بقاء الخلايا الطافرة مع بقاء الخلايا الضابطة المزروعة في نفس الفأر.
يحدث مرض السكري من النوع الأول (T1D) بسبب تدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا المنتجة للأنسولين في البنكرياس. يؤدي فقدان كتلة خلايا بيتا إلى نقص الأنسولين وارتفاع السكر في الدم. يعتمد مرضى T1D على الحقن اليومية المتعددة للأنسولين الخارجي ويعانون من نوبات من ارتفاع السكر في الدم الشديد ونقص السكر في الدم طوال حياتهم. تشمل المضاعفات المرتبطة بهذه الحلقات اعتلال الشبكية السكري ، وانخفاض وظائف الكلى ، والاعتلال العصبي1.
حقن الأنسولين هي علاج ولكن ليس علاجا ل T1D. ومع ذلك ، فإن استبدال كتلة خلايا بيتا المفقودة لديه القدرة على عكس المرض من خلال تمكين المرضى من إنتاج الأنسولين الخاص بهم. ومع ذلك ، فإن المعروض من الجزر المانحة للجثث محدود2. قد توفر الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية (SC-islets) إمدادات غير محدودة تقريبا من خلايا بيتا للزراعة. أثبتت عدة مجموعات أنه يمكن تمييز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) لتوليد خلايا وظيفية شبيهة ببيتا3،4،5. تشير بيانات التجارب السريرية المبكرة الواعدة إلى أن هذه الخلايا تحافظ على وظيفتها بعد الزرع وقد تمكن المرضى من أن يصبحوا مستقلين عن الأنسولين6. ومع ذلك ، فإن كبت المناعة المزمن مطلوب ، مما يزيد من تعرضهم للإصابة بالسرطان والعدوى. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون العوامل المثبطة للمناعة سامة للخلايا للطعوم على المدىالطويل 7. للقضاء على الحاجة إلى كبت المناعة ، يمكن تعديل الجزر SC وراثيا لحمايتها من المناعة الذاتية المتكررة وكذلك المناعة الخيفية بعد الزرع.
أبحاث الخلايا الجذعية تتطلب الكثير من حيث التكاليف والعمالة. تعد خطوط خلايا الفأر والنماذج الحيوانية أدوات مفيدة للتحديد الأولي والتحقق التجريبي من استراتيجيات حماية الخلايا المزروعة من المناعة الذاتية. يصاب فأر NOD بمرض السكري المناعي الذاتي العفوي مع العديد من أوجه التشابه مع T1D8 البشري ، ويشترك خط خلايا الورم الأنسوليني NIT-1 في خلفية وراثية مع سلالة الفأر9. يمكن نقل مرض السكري بالتبني إلى سلالة الفئران NOD-scid ذات الصلة التي تعاني من نقص المناعة عن طريق حقن خلايا الطحال السكرية من فئران NOD من أجل مزامنة ظهور مرض السكري مؤقتا في الفئران التجريبيةالمكررة 10. يمكن استخدام هذا النموذج لتحديد الأهداف الجينية بسرعة نسبية وبتكلفة زهيدة لمزيد من التحقق في الجزر SC. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق الطريقة لتحديد والتحقق من صحة RNLS ، وهو هدف تم العثور عليه لحماية الجزر البشرية الأولية من المناعة الذاتية في الجسم الحي والجزر المشتقة من iPSC من إجهاد خلايا بيتا في المختبر11. الموصوف هنا هو بروتوكول مباشر لزرع خلايا NIT-1 المعدلة وراثيا ومراقبة بقائها على قيد الحياة بشكل غير جراحي في نموذج نقل بالتبني لمرض السكري المناعي الذاتي في الفئران.
T1D هو مرض مدمر لا يوجد علاج له حاليا. يقدم العلاج ببدائل خلايا بيتا علاجا واعدا للمرضى الذين يعانون من هذا المرض ، ولكن العائق الحاسم أمام هذه الاستراتيجية هو احتمال حدوث هجوم مناعي ذاتي متكرر ضد خلايا بيتا المزروعة. الهندسة الوراثية لخلايا SC-beta لتقليل ظهورها المناعي أو قابليتها للتأثر هي ?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتورة إيريكا ب. كاي والدكتورة يوكي إيشيكاوا على تطوير الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول (انظر المرجع 11). يتم دعم الأبحاث في مختبرات S.K. و PE بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (R01DK120445 ، P30DK036836) ، JDRF ، معهد هارفارد للخلايا الجذعية ، ومؤسسة بيتسون. تم دعم T.S. من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) (T32 DK007260-45) ، وتم دعم K.B. جزئيا من خلال زمالة من مؤسسة Mary K. Iacocca.
0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |