चूहों में ऑटोइम्यून मधुमेह के दत्तक स्थानांतरण मॉडल में ग्राफ्ट सर्वाइवल की बायोल्यूमिनेसेंट निगरानी
Summary
यह प्रोटोकॉल गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (एनओडी) में एनआईटी -1 कोशिकाओं के प्रत्यारोपण और इमेजिंग के लिए एक सरल और न्यूनतम इनवेसिव विधि का वर्णन करता है – गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों को स्प्लेनोसाइट्स के साथ चुनौती दी जाती है।
Abstract
टाइप 1 मधुमेह अग्न्याशय के इंसुलिन उत्पादक बीटा कोशिकाओं के ऑटोइम्यून विनाश की विशेषता है। इस बीमारी के लिए एक आशाजनक उपचार स्टेम सेल-व्युत्पन्न बीटा कोशिकाओं का प्रत्यारोपण है। आनुवंशिक संशोधन, हालांकि, प्रत्यारोपित कोशिकाओं को लगातार ऑटोइम्यूनिटी से बचाने के लिए आवश्यक हो सकते हैं। डायबिटिक माउस मॉडल ऑटोइम्यून हमले से प्रत्यारोपित कोशिकाओं की रक्षा के लिए रणनीतियों के प्रारंभिक मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी उपकरण हैं। यहां वर्णित चूहों में मधुमेह के दत्तक हस्तांतरण मॉडल में प्रत्यारोपण और इमेजिंग सेल ग्राफ्ट के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव विधि है। इस प्रोटोकॉल में, जुगनू लूसिफेरस ट्रांसजीन ल्यूक 2 को व्यक्त करने वाली मुराइन अग्नाशयी बीटा सेल लाइन एनआईटी -1 से कोशिकाओं को इम्यूनोडेफिशिएंसी गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह (एनओडी) -गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंसी (स्सिड) चूहों में चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया जाता है। इन चूहों को एक साथ ऑटोइम्यूनिटी को स्थानांतरित करने के लिए अनायास मधुमेह नोड चूहों से स्प्लेनोसाइट्स के साथ अंतःशिरा इंजेक्शन दिया जाता है। सेल के अस्तित्व की निगरानी के लिए गैर-इनवेसिव बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के माध्यम से ग्राफ्ट को नियमित अंतराल पर चित्रित किया जाता है। उत्परिवर्ती कोशिकाओं के अस्तित्व की तुलना एक ही माउस में प्रत्यारोपित नियंत्रण कोशिकाओं से की जाती है।
Introduction
टाइप 1 मधुमेह (टी 1 डी) अग्न्याशय के इंसुलिन उत्पादक बीटा कोशिकाओं के ऑटोइम्यून विनाश के कारण होता है। बीटा सेल द्रव्यमान के नुकसान के परिणामस्वरूप इंसुलिन की कमी और हाइपरग्लेसेमिया होता है। टी 1 डी रोगी बहिर्जात इंसुलिन के कई दैनिक इंजेक्शन पर भरोसा करते हैं और अपने पूरे जीवन में गंभीर हाइपरग्लेसेमिया और हाइपोग्लाइसीमिया के एपिसोड का अनुभव करते हैं। इन एपिसोड से संबंधित जटिलताओं में मधुमेह रेटिनोपैथी, गुर्दे के कार्य में कमी और न्यूरोपैथी1 शामिल हैं।
इंसुलिन इंजेक्शन एक उपचार है लेकिन टी 1 डी के लिए इलाज नहीं है। खोए हुए बीटा सेल द्रव्यमान को प्रतिस्थापित करना, हालांकि, रोगियों को अपने स्वयं के इंसुलिन का उत्पादन करने में सक्षम बनाकर बीमारी को उलटने की क्षमता है। हालांकि, कैडवेरिक दाता आइलेट्स की आपूर्ति सीमित है। स्टेम सेल-व्युत्पन्न आइलेट्स (एससी-आइलेट्स) प्रत्यारोपण के लिए बीटा कोशिकाओं की लगभग असीमित आपूर्ति प्रदान कर सकते हैं। कई समूहों ने प्रदर्शित किया है कि मानव भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) को कार्यात्मक बीटा जैसी कोशिकाओं 3,4,5 उत्पन्न करने के लिए विभेदित किया जा सकता है। प्रारंभिक नैदानिक परीक्षण डेटा का वादा करने से संकेत मिलता है कि ये कोशिकाएं प्रत्यारोपण के बाद अपना कार्य बनाए रखती हैं और रोगियों को इंसुलिन-स्वतंत्र बनने में सक्षम कर सकतीहैं। क्रोनिक इम्यूनोसप्रेशन की आवश्यकता होती है, हालांकि, इस प्रकार कैंसर और संक्रमण के लिए उनकी संवेदनशीलता बढ़ जाती है। इसके अलावा, इम्यूनोसप्रेसिव एजेंट लंबी अवधि में ग्राफ्ट के लिए साइटोटोक्सिक हो सकतेहैं। इम्यूनोसप्रेशन की आवश्यकता को खत्म करने के लिए, एससी-आइलेट्स को आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है ताकि उन्हें आवर्तक ऑटोइम्यूनिटी के साथ-साथ प्रत्यारोपण के बाद एलोइम्यूनिटी से बचाया जा सके।
स्टेम सेल अनुसंधान लागत और श्रम में अत्यधिक मांग है। माउस सेल लाइनें और पशु मॉडल ऑटोइम्यूनिटी से प्रत्यारोपित कोशिकाओं की रक्षा के लिए रणनीतियों की प्रारंभिक पहचान और प्रयोगात्मक सत्यापन के लिए उपयोगी उपकरण हैं। एनओडी माउस मानव टी 1 डी8 के लिए कई समानताओं के साथ सहज ऑटोइम्यून मधुमेह विकसित करता है, और एनआईटी -1 इंसुलिनोमा सेल लाइन इस माउस स्ट्रेन 9 के साथ एक आनुवंशिक पृष्ठभूमि साझा करतीहै। प्रयोगात्मक चूहों 10 में मधुमेह की शुरुआत को अस्थायी रूप से सिंक्रनाइज़ करने के लिए एनओडी चूहों से मधुमेह स्प्लेनोसाइट्स के इंजेक्शन के माध्यम से मधुमेह को संबंधित इम्यूनोडेफिशिएंट एनओडी-स्सिड माउस स्ट्रेन में स्थानांतरितकिया जा सकता है। इस मॉडल का उपयोग एससी-आइलेट्स में आगे के सत्यापन के लिए अपेक्षाकृत जल्दी और सस्ते में आनुवंशिक लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। हाल ही में, इस विधि को आरएनएलएस की पहचान और मान्य करने के लिए लागू किया गया था, एक लक्ष्य जो विवो में ऑटोइम्यूनिटी से प्राथमिक मानव आइलेट्स की रक्षा करने और विट्रो11 में बीटा सेल तनाव से आईपीएससी-व्युत्पन्न आइलेट्स की रक्षा के लिए पाया गया था। यहां वर्णित आनुवंशिक रूप से इंजीनियर एनआईटी -1 कोशिकाओं को प्रत्यारोपण करने और चूहों में ऑटोइम्यून मधुमेह के दत्तक हस्तांतरण मॉडल में उनके अस्तित्व की गैर-आक्रामक रूप से निगरानी करने के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल है।
Protocol
Representative Results
Discussion
टी 1 डी एक विनाशकारी बीमारी है जिसके लिए वर्तमान में कोई इलाज मौजूद नहीं है। बीटा सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी इस बीमारी वाले रोगियों के लिए एक आशाजनक उपचार प्रदान करती है, लेकिन इस रणनीति के लिए महत्वपूर्ण ब…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि विकसित करने के लिए डॉ एरिका पी काई और डॉ युकी इशिकावा को धन्यवाद देते हैं (रेफरी 11 देखें)। एस.के. और पी.वाई. की प्रयोगशालाओं में अनुसंधान को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (आर01डीके120445, पी30डीके036836), जेडीआरएफ, हार्वर्ड स्टेम सेल इंस्टीट्यूट और बीट्सन फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया जाता है। टी.एस. को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (एनआईडीडीके) (टी 32 डीके007260-45) से एक पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, और केबी को मैरी के. इयाकोका फाउंडेशन से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
Referências
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