Detta protokoll beskriver en enkel och minimalt invasiv metod för transplantation och avbildning av NIT-1-celler i icke-överviktiga diabetiska (NOD)-svåra kombinerade immunbristfälliga möss som utmanas med splenaocyter renade från spontant diabetiska NOD-möss.
Typ 1-diabetes kännetecknas av den autoimmuna förstörelsen av de insulinproducerande betacellerna i bukspottkörteln. En lovande behandling för denna sjukdom är transplantation av stamcellshärledda betaceller. Genetiska modifieringar kan dock vara nödvändiga för att skydda de transplanterade cellerna från ihållande autoimmunitet. Diabetiska musmodeller är ett användbart verktyg för den preliminära utvärderingen av strategier för att skydda transplanterade celler från autoimmuna attacker. Här beskrivs en minimalt invasiv metod för transplantation och avbildning av celltransplantat i en adoptiv överföringsmodell av diabetes hos möss. I detta protokoll transplanteras celler från den murina betacellinjen NIT-1 som uttrycker eldflugans luciferastransgen luc2 subkutant till immunbristfälliga icke-överviktiga diabetiker (NOD)-svåra kombinerade immunbristfälliga (scid) möss. Dessa möss injiceras samtidigt intravenöst med splenocyter från spontant diabetiska NOD-möss för att överföra autoimmunitet. Transplantaten avbildas med jämna mellanrum via icke-invasiv bioluminescerande avbildning för att övervaka cellöverlevnaden. Överlevnaden av muterade celler jämförs med kontrollceller transplanterade i samma mus.
Typ 1-diabetes (T1D) orsakas av den autoimmuna förstörelsen av de insulinproducerande betacellerna i bukspottkörteln. Förlusten av betacellmassa resulterar i insulinbrist och hyperglykemi. T1D-patienter förlitar sig på flera dagliga injektioner av exogent insulin och upplever episoder av svår hyperglykemi och hypoglykemi under hela livet. Komplikationerna relaterade till dessa episoder inkluderar diabetisk retinopati, nedsatt njurfunktion och neuropati1.
Insulininjektioner är en behandling men inte ett botemedel mot T1D. Att ersätta den förlorade betacellmassan har dock potential att vända sjukdomen genom att göra det möjligt för patienter att producera sitt eget insulin. Tillgången på kadaveriska donatoröar är dock begränsad2. Stamcellshärledda öar (SC-öar) kan ge ett praktiskt taget obegränsat utbud av betaceller för transplantation. Flera grupper har visat att mänskliga embryonala stamceller (ESC) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) kan differentieras för att generera funktionella beta-liknande celler 3,4,5. Lovande tidiga data från kliniska prövningar tyder på att dessa celler bibehåller sin funktion efter transplantation och kan göra det möjligt för patienter att bli insulinoberoende6. Kronisk immunsuppression krävs dock, vilket ökar deras mottaglighet för cancer och infektion. Dessutom kan immunsuppressiva medel vara cytotoxiska för transplantat på lång sikt7. För att eliminera behovet av immunsuppression kan SC-öar modifieras genetiskt för att skydda dem från återkommande autoimmunitet samt alloimmunitet efter transplantation.
Stamcellsforskning är mycket krävande i kostnader och arbetskraft. Muscellinjer och djurmodeller är användbara verktyg för initial identifiering och experimentell validering av strategier för att skydda transplanterade celler från autoimmunitet. NOD-musen utvecklar spontan autoimmun diabetes med många likheter med human T1D8, och NIT-1-insulinomcellinjen delar en genetisk bakgrund med denna musstam9. Diabetes kan adoptivt överföras till den relaterade immunbristfälliga NOD-scid musstammen via injektion av diabetiska splenocyter från NOD-möss för att temporärt synkronisera uppkomsten av diabetes i replikerade experimentella möss10. Denna modell kan användas för att identifiera genetiska mål relativt snabbt och billigt för vidare validering i SC-öar. Nyligen tillämpades metoden för att identifiera och validera RNLS, ett mål som visade sig skydda primära humana öar från autoimmunitet in vivo och iPSC-härledda öar från betacellstress in vitro11. Här beskrivs ett enkelt protokoll för att transplantera genetiskt modifierade NIT-1-celler och icke-invasivt övervaka deras överlevnad i en adoptiv överföringsmodell av autoimmun diabetes hos möss.
T1D är en förödande sjukdom för vilken det för närvarande inte finns något botemedel. Betacellsersättningsterapi erbjuder en lovande behandling för patienter med denna sjukdom, men det kritiska hindret för denna strategi är potentialen för återkommande autoimmuna attacker mot de transplanterade betacellerna. Gentekniken av SC-beta-celler för att minska deras immunsynlighet eller mottaglighet är en potentiell lösning på detta problem. Här beskrivs ett protokoll för icke-invasiv avbildning av transplante…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Erica P. Cai och Dr. Yuki Ishikawa för att ha utvecklat metoden som beskrivs i detta protokoll (se ref. 11). Forskning i SK och PY: s laboratorier stöds av bidrag från National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Harvard Stem Cell Institute och Beatson Foundation. T.S. stöddes av ett postdoktoralt stipendium från National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), och K.B. stöddes delvis av ett stipendium från Mary K. Iacocca Foundation.
0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |