JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Environment

En 3D-kulturmetode af sfæroider af embryonale og leverzebrafiskcellelinjer

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64859
, , , , , , , , ,
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department,Grupo Boticário, 3Department of Cell Biology,Federal University of Paraná (UFPR), 4Department of Genetics,Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

Her præsenterer vi en effektiv, nem og hurtig 3D-kulturprotokol til dannelse af sfæroider af to zebrafisk (Danio rerio) cellelinjer: ZEM2S (embryo) og ZFL (normal hepatocyt).

Abstract

Fiskecellelinjer er lovende in vitro-modeller til økotoksicitetsvurdering; konventionelle enkeltlagskultursystemer (2D-kultur) har imidlertid velkendte begrænsninger (f.eks. Kulturlevetid og vedligeholdelse af nogle in vivo-cellulære funktioner). Således er 3D-kulturer, såsom sfæroider, blevet foreslået, da disse modeller kan reproducere vævslignende strukturer og bedre genvinde in vivo-betingelserne . Denne artikel beskriver en effektiv, nem og hurtig 3D-kulturprotokol til dannelse af sfæroider med to zebrafisk (Danio rerio) cellelinjer: ZEM2S (embryo) og ZFL (normal hepatocyt). Protokollen består i at platte cellerne i en rundbundet, ultra-lav vedhæftning, 96-brøndplade. Efter 5 dage under orbital omrystning (70 o / min) dannes en enkelt sfærisk pr. Brønd. De dannede sfæroider præsenterer stabil størrelse og form, og denne metode undgår dannelsen af flere sfæroider i en brønd; Det er således ikke nødvendigt at håndplukke sfæroider af lignende størrelser. Letheden, hastigheden og reproducerbarheden af denne sfæroidmetode gør den nyttig til in vitro-test med høj kapacitet.

Introduction

Sfæroider er små kugler af celler, der dannes, når celler dyrkes i tæt celle-til-celle-kontakt i 3D-kultur. Sfæroiders evne til at efterligne in vivo-vævsmiljøet er allerede blevet undersøgt i en række cellelinjer og primære celler 1,2. Selv om kuglesfæroider er veludviklede til toksicitetsundersøgelser af pattedyr, er udviklingen af sfæroider til toksicitetsundersøgelser med hvirveldyr uden for pattedyr (f.eks. fisk) stadig i gang3. For fiskecellelinjer er sfæroider blevet udviklet ved en række forskellige metoder, såsom orbital shaking (OS) ved hjælp af forskellige typer brøndplader 3,4,5,6,7 og metoden til magnetisk levitation ved hjælp af magnetiske nanopartikler 8. Imidlertid kan nogle af disse dyrkningsmetoder til sfæroider have flere ulemper end andre.

For eksempel kan gyratoriske metoder i store mikroplader (plader med 24 brønde) generere et stort antal sfæroider, der varierer i størrelse og form; Faktisk er multi-sfærisk strukturdannelse blevet demonstreret7. Dette kræver en intens indsats for at håndplukke sfæroider med en lignende størrelse og form til et eksperiment. Den hængende dråbe 3D-kulturmetode bruges almindeligvis til at generere sfæroider af pattedyrcellelinjer 1,2,9,10,11, hvorved der kan genereres enkelte sfæroider pr. dråbe, hvilket undgår de ovenfor beskrevne problemer. Men selvom en modificeret hængende dråbemetode (hængende dråbe + orbital rystning) er i stand til at generere ZFL-sfæroider ved hjælp af en billig metode, har den sine ulemper12. De dannede cellulære aggregater kan ikke opretholdes i lange perioder i dråberne; Således skal de overføres til brøndplader. Denne proces kræver intens håndtering og lange perioder med arbejde i en laminær strømningshætte, da den udføres dråbevis ved hjælp af en mikropipette12. Derudover kræver denne metode 10 dage for fuldt ud at danne ZFL-sfæroider (5 dage i hængende dråbe + 5 dage i OS)12. Disse ulemper kan begrænse anvendelsen af 3D-fiskesfæroider til toksicitetstest, især i betragtning af potentielle anvendelser til kemisk prioritering og produktbæredygtighed.

Således beskriver denne artikel en 3D-kulturprotokol, der er i stand til at generere enkeltsfæroider af ZFL (D. rerio normal hepatocyt) og ZEM2S (D. rerio blastula fase embryo) cellelinjer baseret på den kombinerede anvendelse af 96-brønds, ultra-lave fastgørelsesplader (ULA-plader) og en orbital shaker (22 mm rotationsdiameter). Den anvendte metode er enkel og reproducerbar og kan generere et stort antal sfæroider af samme størrelse og form på kort tid (5 dage). Fordelene ved denne metode kan understøtte anvendelsen af fisk 3D-modeller til akvatiske toksicitetsundersøgelser i både industrien og den akademiske verden samt fremskridt med at implementere alternative metoder til økotoksicitetstest.

Protocol

De vigtigste trin til generering af 3D-sfæroider af ZFL- og ZEM2S-cellelinjer i en rundbundet plade med 96 brønde er vist i figur 1. BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle materialer, der anvendes i denne protokol, og tabel 1 for opløsninger og kulturmedier, der anvendes i denne protokol. 1. Cellekulturmedium og enkeltlagskulturer Dyrk begge cellelinjer…

Representative Results

Brønd med stabil størrelse og form dannes ved denne metode. Figur 2 illustrerer dannelsesprocessen af enkelte sfæroider af ZFL- og ZEM2S-celler i en brønd i en ULA-plade under orbitalomrystning (70 omdr./min.). ZFL- og ZEM2S-cellelinjerne har forskellig adfærd i 3D-kultur. ZEM2S-cellelinjen præsenterer funktioner, der giver evnen til let at danne en sfærisk form siden den første dag i orbitalrystningen (figur 2E), mens ZFL-cellelinjen kræver 5 dage for …

Discussion

Dette er en enkel, nem og hurtig metode til generering af sfæroider af zebrafiskelever og embryocellelinjer. Denne metode blev udviklet af denne gruppe baseret på modifikationer af eksisterende 3D-sfæroidmetoder til at overvinde problemer rapporteret i videnskabelige undersøgelser relateret til sfærisk dannelse samt usikkerheder i datanøjagtighed fra 3D-sfæroidassays. De rapporterede problemer ligger f.eks. i vanskeligheder med håndtering, den tidskrævende karakter af generering af sfæroider, nødvendigheden af…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Til minde om Dr. Márcio Lorencini, medforfatter af dette arbejde, en fremragende forsker inden for kosmetik og dedikeret til at fremme kosmetisk forskning i Brasilien. Forfatterne er taknemmelige for multibrugerlaboratoriet i fysiologiafdelingen (UFPR) for tilgængelighed af udstyr og for den økonomiske støtte fra koordineringen til forbedring af personale på videregående uddannelser (CAPES, Brasilien) (finanskode 001) og Grupo Boticário.

Materials

96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile Corning 7007
DMEM, powder, high glucose, pyruvate Gibco 12800-017
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026
HEPES (1M) Gibco 15630080
Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software  National
Institutes of Health, USA		 Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 Medium, powder Gibco 41300021
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014
FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate, powder,  bioreagent for molecular biology Sigma-Aldrich S5761
Trypan blue stain (0,4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
  2. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
  3. Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
  4. Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids – A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
  5. Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
  6. Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
  7. Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
  8. Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
  10. Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
  11. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
  12. de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
  13. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).
  14. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
  15. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
  16. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
  17. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  18. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  19. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
  20. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
  21. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022)
  22. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
  23. Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
  24. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
  25. Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
  26. Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
  27. Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
  28. Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
  29. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  30. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).

Tags

3D Cell CultureZebrafish Cell LinesSpheroidsIn Vitro ModelToxicity TestingCell ViabilityTrypan BlueCell Counting96-well ULA Plate
check_url/64859?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
de Souza, I. R., Micali Canavez, A. D. P., Schuck, D. C., Costa Gagosian, V. S., de Souza, I. R., de Albuquerque Vita, N., da Silva Trindade, E., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64859, doi:10.3791/64859 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image