Embriyonik ve Karaciğer Zebra Balığı Hücre Hatlarının Sferoidlerinin 3D Kültür Yöntemi
Summary
Burada, iki zebra balığı (Danio rerio) hücre hattının sferoidlerinin oluşumu için etkili, kolay ve hızlı bir 3D kültür protokolü sunuyoruz: ZEM2S (embriyo) ve ZFL (normal hepatosit).
Abstract
Balık hücre hatları, ekotoksisite değerlendirmesi için in vitro modeller vaat etmektedir; Bununla birlikte, geleneksel tek katmanlı kültür sistemlerinin (2D kültür) iyi bilinen sınırlamaları vardır (örneğin, kültürün uzun ömürlülüğü ve bazı in vivo hücresel fonksiyonların bakımı). Bu nedenle, sferoidler gibi 3D kültürler önerilmiştir, çünkü bu modeller doku benzeri yapıları yeniden üretebilir ve in vivo koşulları daha iyi yeniden yakalayabilir. Bu makalede, iki zebra balığı (Danio rerio) hücre hattına sahip sferoidlerin oluşumu için etkili, kolay ve hızlı bir 3D kültür protokolü açıklanmaktadır: ZEM2S (embriyo) ve ZFL (normal hepatosit). Protokol, hücrelerin yuvarlak tabanlı, ultra düşük bir ataşman, 96 delikli bir plaka ile kaplanmasından oluşur. Orbital sarsıntı altında 5 gün sonra (70 rpm), kuyu başına tek bir sferoid oluşur. Oluşan sferoidler kararlı boyut ve şekil sunar ve bu yöntem bir kuyuda çoklu sferoidlerin oluşumunu önler; Bu nedenle, benzer boyutlardaki sferoidleri elle seçmek gerekli değildir. Bu sferoid yöntemin kolaylığı, hızı ve tekrarlanabilirliği, yüksek verimli in vitro testler için kullanışlı olmasını sağlar.
Introduction
Sferoidler, 3D kültürde hücreler yakın hücreden hücreye temasta kültürlendiğinde oluşan küçük hücre küreleridir. Sferoidlerin in vivo doku ortamını taklit etme kapasitesi, çeşitli hücre hatlarında ve birincil hücrelerde zaten incelenmiştir 1,2. Bununla birlikte, sferoidler memeli toksisitesi çalışmaları için iyi geliştirilmiş olmasına rağmen, memeli olmayan omurgalılarla (örneğin balık) toksisite çalışmaları için sferoidlerin geliştirilmesi hala devam etmektedir3. Balık hücre hatları için, sferoidler, farklı tipte kuyu plakaları 3,4,5,6,7 kullanan yörüngesel sallama (OS) ve manyetik nanopartiküller 8 kullanılarak manyetik kaldırma yöntemi gibi çeşitli farklı yöntemlerle geliştirilmiştir. Bununla birlikte, sferoidler için bu kültür yöntemlerinden bazıları diğerlerinden daha fazla dezavantaja sahip olabilir.
Örneğin, büyük mikroplakalardaki (24 kuyucuklu plakalar) girdat yöntemleri, boyut ve şekil bakımından farklılık gösteren çok sayıda sferoid üretebilir; Gerçekten de multi-sferoid yapı oluşumu gösterilmiştir7. Bu, bir deney için benzer boyut ve şekle sahip sferoidleri elle seçmek için yoğun çaba gerektirir. Asılı damla 3D kültür yöntemi, 1,2,9,10,11 memelihücre hatlarının sferoidlerini üretmek için yaygın olarak kullanılır, böylece damla başına tek küre üretilebilir ve yukarıda açıklanan sorunlardan kaçınılabilir. Bununla birlikte, modifiye edilmiş bir asılı damla yöntemi (asılı damla + yörüngesel sallama) ucuz bir yöntem kullanarak ZFL sferoidleri üretebilse de, dezavantajları vardır12. Oluşan hücresel agregalar damlalarda uzun süre muhafaza edilemez; Bu nedenle, kuyu plakalarına aktarılmaları gerekir. Bu işlem, laminer akış davlumbazında yoğun kullanım ve uzun süreli çalışma gerektirir, çünkü bir mikropipet12 kullanılarak damla damla gerçekleştirilir. Ek olarak, bu yöntem ZFL sferoidlerini tam olarak oluşturmak için 10 gün gerektirir (asılı damlada 5 gün + işletim sisteminde 5 gün)12. Bu dezavantajlar, özellikle kimyasal önceliklendirme ve ürün sürdürülebilirliği için potansiyel uygulamalar göz önüne alındığında, toksisite testi için 3D balık sferoidlerinin uygulanmasını sınırlayabilir.
Bu nedenle, bu makalede, 96 kuyulu, ultra düşük bağlantı plakalarının (ULA-plakaları) ve bir orbital çalkalayıcının (22 mm dönme çapı) kombine kullanımına dayanan ZFL (D. rerio normal hepatosit) ve ZEM2S (D. rerio blastula faz embriyosu) hücre hatlarının tek kürelerini üretebilen bir 3D kültür protokolü açıklanmaktadır. Uygulanan yöntem basit ve tekrarlanabilir ve kısa sürede (5 gün) benzer boyut ve şekilde çok sayıda sferoid üretebilir. Bu yöntemin avantajları, hem endüstride hem de akademide sucul toksisite çalışmaları için balık 3D modellerinin uygulanmasını ve ayrıca ekotoksisite testi için alternatif yöntemlerin uygulanmasındaki ilerlemeyi destekleyebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu, zebra balığı karaciğer ve embriyo hücre hatlarının kürelerini üretmek için basit, kolay ve hızlı bir yöntemdir. Bu yöntem, bu grup tarafından, küresel oluşum ile ilgili bilimsel çalışmalarda bildirilen sorunların üstesinden gelmek için mevcut 3D sferoid yöntemlerin modifikasyonlarına ve 3D sferoid tahlillerden elde edilen veri doğruluğundaki belirsizliklere dayanarak geliştirilmiştir. Örneğin, bildirilen sorunlar, sferoidlerin üretilmesinin zaman alıcı doğası, bir tahlil yapmak iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmanın ortak yazarı Dr. Márcio Lorencini’nin anısına, kozmetik alanında mükemmel bir araştırmacı ve Brezilya’da kozmetik araştırmaları teşvik etmeye adanmıştır. Yazarlar, ekipman kullanılabilirliği ve Yüksek Öğrenim Personelinin İyileştirilmesi Koordinasyonu (CAPES, Brezilya) (Finans Kodu 001) ve Grupo Boticário’nun finansal desteği için Fizyoloji Bölümü’ndeki (UFPR) Çok Kullanıcılı Laboratuvara minnettardır.
Materials
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids – A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022)
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
