Summary
Bu protokol, bir burun damlası yoluyla silika süspansiyonlarına tekrar tekrar maruz kalma yoluyla bir fare silikoz modeli oluşturmak için bir yöntemi açıklar. Bu model, yüksek tekrarlanabilirlik ve ekonomi ile insan silikozunun patolojik sürecini verimli, rahat ve esnek bir şekilde taklit edebilir.
Abstract
Silikoz, endüstriyel bir ortamda solunum kristali silika tozuna (CSD) maruz kalmaktan kaynaklanabilir. İnsanlarda silikozun patofizyolojisi, taranması ve tedavisi, fare silikoz modeli kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Farelerin CSD'yi tekrar tekrar akciğerlerine solumasını sağlayarak, fareler insan silikozunun klinik semptomlarını taklit edebilir. Bu metodoloji, zaman ve çıktı açısından pratik ve verimlidir ve ameliyat nedeniyle üst solunum yollarında mekanik yaralanmaya neden olmaz. Ayrıca, bu model silikozisin akut/kronik dönüşüm sürecini başarılı bir şekilde taklit edebilir. Ana prosedürler aşağıdaki gibiydi. Sterilize edilmiş 1-5 μm CSD tozu tamamen öğütüldü, tuzlu su içinde süspanse edildi ve 30 dakika boyunca ultrasonik su banyosunda dağıtıldı. İzofluran kaynaklı anestezi altındaki fareler, yaklaşık 2 saniye boyunca sığ hızlı solunumdan derin, yavaş aspirasyona geçti. Fare bir avucun içine yerleştirildi ve başparmak ucu, hava yolunu düzeltmek için farenin çenesinin dudak kenarına hafifçe dokundu. Her ekshalasyondan sonra, fareler silika süspansiyonunu bir burun deliğinden damla damla soluyarak işlemi 4-8 saniye içinde tamamladılar. Farelerin solunumu stabilize olduktan sonra, solunan CSD'nin öksürmesini önlemek için göğüsleri okşandı ve okşandı. Fareler daha sonra kafese geri döndü. Sonuç olarak, bu model, üst solunum yolundan terminal bronşiyollere ve alveollere kadar küçük parçacıkların akciğere tipik fizyolojik geçişi boyunca CSD'yi ölçebilir. Ayrıca, çalışanların iş nedeniyle tekrarlayan maruziyetini de çoğaltabilir. Model bir kişi tarafından gerçekleştirilebilir ve pahalı ekipmanlara ihtiyaç duymaz. İnsan silikozunun hastalık özelliklerini yüksek tekrarlanabilirlik ile rahat ve etkili bir şekilde simüle eder.
Introduction
İşçiler kaçınılmaz olarak, solunabilen ve madencilik, çömlekçilik, cam, kuvars işleme ve beton 1,2 dahil olmak üzere çok sayıda mesleki bağlamda daha toksik olan düzensiz kristal silika tozuna (CSD) maruz kalmaktadır. Silikoz olarak bilinen kronik bir toz soluma durumu, ilerleyici akciğer fibrozuna neden olur3. Epidemiyolojik verilere göre, silikoz insidansı son birkaç on yılda küresel olarak azalmaktadır, ancak son yıllarda artmakta ve gençleri etkilemektedir 4,5,6. Silikozisin altında yatan mekanizma, sinsi başlangıcı ve uzun kuluçka süresi nedeniyle bilimsel araştırmalar için önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Silikozun nasıl geliştiği hala bilinmemektedir. Ayrıca, mevcut hiçbir ilaç silikoz ve ters pulmoner fibrozisin ilerlemesini durduramaz.
Silikoz için mevcut fare modelleri, karışık bir CSD süspansiyonunun trakeal alımını içerir. Örneğin, anesteziden sonra servikal trakea travmasını benimseyerek CSD'nin akciğerlere uygulanması, insanların boya tozuna tekrar tekrar maruz kalmasına uymaz7. Ortam tozuna maruz kalmanın bireyler üzerindeki etkisi, bu toksik maddenin çevresel konsantrasyonlarını daha doğru bir şekilde yansıtan aerosoller şeklinde CSD'ye maruz bırakılarak incelenebilir8. Bununla birlikte, çevresel CSD, fare burnunun benzersiz fizyolojik yapısı nedeniyle doğrudan akciğerleresolunamaz 9. Ayrıca, bu teknolojiyle ilişkili ekipman pahalıdır ve bu da araştırmacıların fare silikoz model10'u yeniden değerlendirmesine neden olmuştur. CSD süspansiyonunu 2 hafta içinde beş kez burun akıntısı yoluyla soluyarak, dinamik bir silikoz modeli oluşturmak mümkün oldu. Bu model, kullanımı kolay olmasının yanı sıra tutarlı ve güvenlidir. Bu çalışmanın farelerde CSD'nin tekrar tekrar solunmasına izin verdiğine dikkat etmek önemlidir. Bu prosedürle oluşturulan fare silikoz modelinin araştırma gereksinimleri için daha faydalı olması beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun (NIH Yayın No. 8023, 1978'de revize edilmiştir) yönergelerini takip etti ve Anhui Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Fareleri yönetmek ve beslemek
- 20 sağlıklı C57BL / 6 erkek fareyi deney veya araç gruplarına 1: 1 oranında atayın. Fareleri 1 hafta boyunca yeni ortama alıştırın.
- Günde 12 saatlik sabit bir ışık süresi sağlayın. Hassas zamanlama için bir zaman kontrol anahtarı kullanın.
2. CSD süspansiyonunun hazırlanması
- Burun damlamalarından en az 1 gün önce, silikayı bir akik harcında 0,5 saat öğütün.
- Kristal parçacıkların boyutunu ve şeklini gözlemleyin. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak temsili fotoğraflar çekin.
- Numuneyi SEM'e hazırlamak için parçacıkları bağlamak için iletken bant kullanın. Sıkıca bağlanmamış silikon parçacıklarını nazikçe üflemek için bir saç kurutma makinesi kullanın.
- Numune odasını boşaltın, yüksek basıncı açın ve görüntüyü yakalayın.
NOT: Lens ile numune arasındaki çalışma mesafesi (WD) 5.9 mm'dir, hızlanma voltajı 2.0 kV'dur ve büyütme (Mag) 100.000x'tir, SignalA dedektörü kullanılarak. Parçacıklar düzensiz kristalleşme ile dağılır ve yaklaşık% 80'i 1-5 μm çapa sahiptir (Şekil 1A).
- 20 mg / mL steril CSD süspansiyonu yapın. CSD'yi steril salin kullanarak seyreltin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) ultrasonik bir çalkalayıcı (40 kHz, 80 W) ile karıştırın.
- Burun damlalarını uygulamadan önce CSD süspansiyonunu bir vorteks karıştırıcısında 10 saniye boyunca iyice karıştırın ve karıştırın.
3. Fareye burun damlaları verilmesi
- Bir anestezi makinesinde 3.6 mL / s'lik bir dozda% 2 izofluran içeren bir fareyi hızla uyuşturun (Şekil 1B, sol panel).
NOT: Anestezinin teknisyen tarafından solunmasını önlemek için anestezi çeker ocakta yapılmalıdır. Farelerde hızlı ve düzensiz solunumdan yavaş ve sabit bir duruma geçişi gözlemleyerek yeterli anestezi derinliğinde olduğundan emin olun. - 4-8 saniye içinde nazal olarak 50 μL CSD damlatın (Şekil 1B, sağda).
- Burun akıntısı için, farenin başını işaret parmağının ucuyla araştırmacının metakarpofalangeal eklemine yerleştirin.
- Fareyi, dört parmağınızı hafifçe bükerek ve hava yolunu düzeltmek için başparmağın ucu farenin alt dudağına hafifçe değecek şekilde yüzüstü pozisyonda tutun. Öğürme refleksini ortaya çıkarmak için farenkse dokunmaktan kaçının.
- 200 μl'lik bir pipet kullanarak 50 μl sıvıyı aspire edin. Sıvıyı, farenin solunum hızına bağlı olarak üç ila dört bölünmüş dozda farenin burun boşluğuna bırakın. Her damlatma 15 ila 20 μl sıvıdan oluşmalıdır. Damlaları 3 günde bir, 12 gün içinde 5 kez uygulayın. Kontrol faresine eşit miktarda salin uygulayın.
- Farenin kalp bölgesine 5x-10x 5 saniye boyunca nazikçe masaj yapın.
- Farenin gövdesini avuç içi ile tutun, başparmak ve işaret parmağınızla boynun arkasındaki deriyi sıkıştırın ve farenin arka bacaklarını diğer parmaklarınızla sabitleyin. Ardından, diğer elin işaret parmağı ile farenin kalp atışı bölgesine 5 saniye içinde 5-10 kez hafifçe bastırın.
- Farenin solunumu stabilize olduğunda, onu bir ısıtma yastığı olan bir kurtarma kafesine yerleştirin ve anesteziden kurtulana kadar gözlemleyin, ardından fareyi ev kafesine geri koyun. Fareyi 31 günde feda edin.
4. Akciğer dokularının toplanması ve parafin kesitinin hazırlanması
- İntraperitoneal olarak 0.18 mL% 10 kloral hidrat enjekte edin, farelerin ayak parmağı veya kuyruk stimülasyonuna yanıt vermemesini sağlayın (dişli forseps kullanılarak gerçekleştirilir). Ardından, bir sonraki adıma geçin.
- Fare uzuvlarını bir köpük test tahtasına sabitleyin ve kürkü nemlendirmek için% 75 alkol püskürtün. Köprücük kemiğinin orta hattındaki torasik kaburgaların çoğunu çıkarın ve kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için farelerin göğüs boşluğunu açın.
- Sağ atriyumu oftalmik cerrahi makasla hemen kesin ve tam kanın akmasına izin vermek için sol atriyal atışta kalp ucundan en büyük genlikle 20 mL fosfat tamponu (PBS) yavaşça enjekte edin. Daha sonra, sağ akciğerin alt lobunu çıkarın ve western blotting analizi için -80 ° C'de saklayın.
- PBS enjeksiyonundan sonra aynı bölgede 10 mL %4 paraformaldehit (PFA) perfüze etmeye devam edin. Kalan akciğeri toplayın ve patolojik analiz için numuneyi 30 mL% 4 PFA'da saklayın.
- 72 saatlik fiksasyondan sonra, numuneleri parafine gömün.
- RT'de her biri 1 saat boyunca deiyonize suda (%60, %70, %80, %90, %100) kademeli bir dizi etanol (EtOH) seyreltmesi yoluyla dokuları dehidre edin. Numuneyi her biri 1 saat boyunca iki yıkama ksilen ile temizleyin.
- Numuneleri erimiş parafin mumu ile 2 saat boyunca 50 °C'ye ısıtarak sızdırın. Bu işlemi başka bir silindirde tekrarlayın. Balmumu kalıplarını sertleşmesi için 1 saat mendillerle soğutun.
- Balmumu sertleştikten ve doku gömüldükten sonra, dokuyu 5 μm'de dilimlemek için bir parafin kesit alma makinesi kullanın. Hassas kesit alma ve kızak montaj adımları daha önce açıklanmıştır11.
NOT: Yeterli doku perfüzyonu, 10 mL %4 PFA aldıktan sonra kas seğirmesi ve kuyruk bükülmesinin "S" şeklinde bükülmesi veya fleksiyonu ile gösterilir.
5. Hematoksilen ve eozin (HE) boyamanın yapılması
- Slaytlara yapışmayı ve daha iyi deparafinasyonu sağlamak için parafine gömülü dokuları sıcak bir plaka üzerinde (60 ° C) 4 saatten fazla ısıtın.
- Parafin bölümlerini mumdan arındırın ve nemlendirin. Slaytları numunelerle ıslatın 2x her seferinde 30 dakika boyunca ksilen içinde. Daha sonra, bunları susuz etanole, ardından sırasıyla %95, %85, %75 alkol ve deiyonize suya 5 dakika batırın.
- Hematoksilen ve eozin boyama yapın. Dokuları bir hematoksilen boyama kovasında 10 dakika boyayın. 5 dakika boyunca hafifçe akan su ile durulayın. Ardından, slaytları 10 saniye boyunca eozin boyama kovasına batırın.
- Numuneleri %75, %85, %95 ve susuz etanol içinde her biri 5 dakika kurutun. Doku bölümlerini 5 dakika boyunca ksilene batırarak temizleyin. Bölümü yaklaşık 60 μL nötr reçine damlası ile kapatın. Kapak sürgüsünü bölümün üzerine yerleştirin ve hava kabarcıklarını önlemek için dikkatlice indirin.
6. Masson boyama yapmak
- Adım 5.2'de belirtildiği gibi parafin örneklerini mumdan arındırın ve nemlendirin. Ardından, hücre çekirdeklerini 10 dakika boyunca% 50 Weigert hematoksilen ile boyayın. Dokuyu asidik etanol sıvılaştırmasında 10 saniye bekletin ve doku slaytlarını çekirdeklerin mavileşmesi için akan su ile nazikçe durulayın.
NOT: Kullanmadan hemen önce Weigert'in hematoksilen boyama solüsyonunu hazırlayın. - Numuneleri 7 dakika boyunca Lichun kırmızı boyama solüsyonu damlaları (her doku lamı için 40 μL) ile boyayın ve bağlanmamış Lichun kırmızı boyasını çıkarmak için 1 dakika boyunca zayıf bir asit çalışma solüsyonu (% 30 hidroklorik asit) ile yıkayın.
- 20 saniye boyunca %95 alkole batırın ve her biri 1-3 saniye boyunca susuz etanol ile 2 kez kurutun. Bundan sonra, dokuları ksilen ile temizleyin ve adım 5.4'te belirtildiği gibi 60 μL nötr reçine damlası ile kapatın.
7. Sirius kırmızı boyama yapılması
- Adım 5.2'de belirtildiği gibi parafin bölümlerini mumdan arındırın ve nemlendirin.
- Sirius kırmızı boyama solüsyonu ile 1 saat boyunca bölümlere sızın.
- Örneklerin hücre çekirdeklerini Mayer hematoksilen boyama solüsyonu ile 8-10 dakika boyayın. Akan su ile 10 dakika boyunca nazikçe durulayın. Ardından, doku slaytlarını kurutun ve temizleyin. Bunları adım 5.4'te belirtildiği gibi kapatın.
8. İmmünohistokimya yapmak
- Parafin örneklerini adım 5.2'de açıklandığı gibi mumdan arındırın ve nemlendirin.
- Örneklere yaklaşık 30 mL'lik 3 mg / mL EDTA antijen alma çözeltisi ile sızın. 20-30 dakika kaynatın. Dokuları deiyonize suyla yıkayın ve ardından %0.5 Tween-20 (PBST) içeren fosfat tamponlu çözelti içinde 5 dakika inkübe edin.
- Örneklerdeki endojen peroksidazı etkisiz hale getirmek için örnekleri %0.3 hidrojen peroksit çözeltisi ile 15 dakika bekletin. Her seferinde 5 dakika boyunca PBST ile 3 kez yıkayın.
NOT:% 0.3 hidrojen peroksit çözeltisi, ışık geçirmez bir ortamda taze yapılmalıdır. - % 0.3 Triton-100 çözeltisi ile numunelerin membranını 15 dakika boyunca geçirgenleştirin. Daha sonra, 1 saat boyunca 30-40 μL% 5 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin.
- Engelleme çözümünü çıkarın. Seyreltilmiş primer antikorlar NF-κB (seyreltme 1:200) ve CD68 (seyreltme 1:1.000) ekleyin ve buharlaşmayı ve ışığı önlemek için numuneleri gece boyunca 2-8 °C'de bir mikroskop lamı IHC ıslak kutusunda inkübe edin.
- Ertesi gün, onları 1 saatliğine RT'ye aktarın. Ardından, her birini 5 dakika boyunca PBST 3x ile yıkayın.
- Numuneleri RT'de tavşan anti-fare yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikorlarda (seyreltme oranı 1:500) 1 saat inkübe edin ve her biri 5 dakika boyunca PBST 3x ile yıkayın.
NOT: Hem primer hem de sekonder antikorlar %5 BSA ile seyreltilmiştir. - Numuneleri, enzim etiketli antikora karşılık gelen 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) substratı ile 5-20 dakika inkübe edin. Optimum boyama yoğunluğuna ulaşıldığında deiyonize su ile reaksiyonu durdurun.
NOT: DAB solüsyonunun taze olarak hazırlanması ve ışıktan korunması gerekir. Renk geliştirme reaksiyonu, boyamanın ne zaman durdurulacağını belirlemek için mikroskop altında gerçek zamanlı olarak gözlemlenmelidir. Pozitif örnekler yoğun lekelenme sergilerken, negatif örnekler renk geliştirmez. - Numuneleri 30 saniye boyunca Weigert hematoksilen ile boyayın. Daha sonra, dokuları 1 dakika boyunca akan su altında durulayın. Ardından, adım 5.4'te belirtildiği gibi doku slaytlarını kurutun, temizleyin ve kapatın.
9. Western blotting analizinin yapılması
- Proteinleri çıkarmak için akciğer dokularını parçalayın. 20 mg akciğer dokusuna 200 μL RIPA çalışma solüsyonu ekleyin.
- El tipi bir elektrikli öğütücü kullanarak dokuyu buz üzerinde 5 dakika homojenize edin ve hafifçe çalkalayarak buz üzerinde 1 saat inkübe edin. Daha sonra homojenatı 4 °C'de 15 dakika boyunca 14.800 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı toplayın ve BCA protein tahlil kiti ile protein konsantrasyonunu belirleyin. Protein depolama solüsyonunu RIPA ile 6 μg/μL proteinde yapın. 80 μL protein lizatına 20 μL 5x yükleme tamponu ekleyin. Protein içeren mikrosantrifüj tüplerini metal bir banyoda (100 °C) 20 dakika ısıtarak ikincil protein yapısını bozar.
- Soğuduktan sonra, her bir tüpe 100 μL protein depolama solüsyonu alın ve numuneleri -80 ° C'lik bir buzdolabında saklayın. Elektroforezden önce protein konsantrasyonunu 1x yükleme tamponu ile 2-3 μg/μL'ye seyreltin.
NOT: Protein ekstraksiyon işlemi buz üzerinde yapılmalıdır. RIPA çalışma çözeltisi için, fosforile protein bozunmasını engellemek için 99 μL RIPA'ya 1 μL 100 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ekleyin. 5x yükleme tamponunu RIPA ile 1:4 oranında seyrelterek 1x yükleme tamponu hazırlayın. - Her oyuğa 20 μg numune ekleyin ve jeli çalıştırın. % 5 konsantre jeller için, proteinlerin aynı başlangıç noktasından elektroforeze edilmesi için 20 dakika boyunca 80 V kullanın. % 10 izole jeller için, farklı moleküler ağırlıktaki proteinlerin mümkün olduğunca ayrılmasını sağlamak için 1 saat boyunca 100 V'ta çalıştırın.
- PVDF membranını 20 saniye boyunca metanol ile önceden etkinleştirin. Proteinleri, 1-2 saat boyunca 400 mA akımla ıslak transfer yöntemini kullanarak PVDF membranına aktarın.
NOT: Elektroforez tankının ve elektrotransfer tankının yatay olduğundan emin olun. Membran transfer işlemi çok fazla ısı ürettiğinden tüm tankı buzla soğutun. - Membranı TBST solüsyonu ile her seferinde 5 dakika, 5 kez yıkayın. Ardından, 1 saat boyunca %5 BSA veya %5 yağsız süt ile bloke edin. Primer antikorlar NF-κB (1: 1.000) ve β-aktin (1: 1.000)% 5 BSA ile seyreltin. Şeritleri antikor çözeltisine batırın ve şeritleri gece boyunca 2-8 °C'de hafifçe sallayın.
- Şeritleri PBST ile yıkayın. Daha sonra, yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge keçi anti-tavşan ikincil antikorunu (1: 10.000) seyreltin ve seyreltilmiş ikincil antikorda RT'de 1 saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
- Gelişmiş bir kemilüminesans (ECL) geliştiricisi hazırlayın, şeridin üzerine bırakın ve 3 dakika inkübe edin.
- Şeridi 20 saniye boyunca bir jel görüntüleyiciye maruz bırakın. Sistem yazılımı ile protein seviyesini değerlendirmek için şeridin gri değerini ölçün. β-aktini dahili kontrol olarak kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farelerde silikozun potansiyel patogenezi önerilen yöntem kullanılarak araştırıldı. Deney grubundaki farelerin vücut ağırlığının kontrol grubuna göre önemli ölçüde azaldığını ve maruziyetin kesilmesinden sonra vücut ağırlığının yavaş yavaş iyileştiğini bulduk. Burada kullanılan optimize edilmiş doz nedeniyle, bu deneyde silikaya maruz kalan farelerde mortalite gözlenmemiştir. CSD'ye tekrarlanan burun akıntısının teknik yol haritası (Şekil 1)'de gösterilmiştir. Daha önce tarif edilen prosedürler CSD süspansiyon hazırlığı, izofluran kaynaklı anestezi, burun akıntısı ve torasik masajıiçeriyordu 12. 4 haftalık statik beslenmeyi takiben kollajen birikimi ve miyofibroblast farklılaşması gösterdik12. Bu toza maruz kalma yöntemini, kömür tozunun neden olduğu pulmoner fibrozun altında yatan mekanizmayı incelemek için kullandık. Makrofajın yeni alt kümeleri ve D vitamininin müdahale etkisi, tek hücreli transkriptom teknolojisiile bulundu 13. Bu çalışmada, farelerde pulmoner fibrozisin ilerlemesi, bronşiyal periferik elastik liflerde hasara neden olan CSD'ye maruz kalma ile önemli ölçüde hızlandırılmıştır (Şekil 2 ve Şekil 3). Silikozis nodülleri CSD içeren makrofajlardan oluşur. Fibrozis nodüler birçok CSD ile zenginleştirilmiştir ve CD68 pozitif makrofajlar bu partikülleri aktif olarak yutar. Bu biriken CSD'ler, lifli odakların oluşumunu teşvik eder. Daha önce de belirtildiği gibi, 4 hafta boyunca CSD'ye maruz kaldıktan sonra, fareler silikon akciğer nodüllerinde kollajen birikimi ve akciğer doku yapısında hasar gibi belirgin lezyonlar elde etti. Bronşları çevreleyen dokuda da hafif yaralanma vardı12. CSD'nin neden olduğu ER stresinin biyolojik süreci, inflamatuar yanıtta yer alan NF-κB ile ilişkilidir (bkz. Şekil 4). Genel olarak, bu bulgular önerilen yaklaşımın fare silikozunun gelişimini etkili bir şekilde simüle edebileceğini göstermektedir.
Şekil 1: Burun akıntısı için beş mikronun altındaki kristal silika tozu (CSD) partikülleri kullanıldı. (A) CSD'nin taramalı elektron mikroskobu (SEM), parçacıkların düzensiz şekilli olduğunu gösterdi. (B) Burun damlası ile fare silikoz modelini hazırlamak için CSD süspansiyonu kullanıldı. Soldaki makine izofluran anestezisi için kullanılır ve sağdaki panel, burun damlasının çalışmasına neden olan kilit noktaları ana hatlarıyla belirtir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sirius kırmızı boyaması, 1 ay boyunca burun damlası CSD ile fare akciğerlerinde fibroz gösterdi. (A) CSD veya salin tedavisini takiben akciğer dokusunda kollajen birikimini ölçmek için Sirius kırmızı boyama yapıldı (bölmelerde sol üst ve sol alt). Polarize mikroskopi, kırmızı ile gösterilen tip 1 kollajen liflerinin silikoz için bir risk faktörü olduğu üç farklı kollajen lifi (kırmızı, sarı ve yeşil) ortaya çıkardı. Bununla birlikte, araç grubunda (sağ yukarı ve alt paneller) anlamlı bir fibrozis bulunmadı. (B) Fibrozis skoru (FS), kontrolden önemli ölçüde farklı olan Sirius kırmızı boyamasına12 dayanan yarı kantitatif bir değerlendirme indeksidir (***P < 0.0001). Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Silikotik nodül oluşumunda makrofajların rolünü izlemek için CSD ile tedavi edilen fare akciğerinde CD68'in immünohistokimya boyaması. Tipik bir silika nodülü, merkezde CSD'nin fagositozundan sonra, periferde makrofajlarla çevrili (HE boyama) sıvılaştırılmış nekroz ile karakterizedir. Ek olarak, CSD, fibrozis (Masson boyama) ile birlikte nodüllerde zenginleştirildi. CD68'in immünohistokimya boyaması akciğer dokusunda makrofajların yaygın olarak bulunduğunu ortaya koydu. Ayrıca, bu makrofajlar, ciddi akciğer hasarına neden olan CSD'yi (polarize ışık mikroskobu, sağ panel altında görülen) yutmuştu. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: CSD ile tedavi edilen fare akciğerindeki NF-κB ekspresyonu . (A) Akciğer dokusunda immünohistokimya boyaması yapıldı. Sağ bölmedeki CSD ile tedavi edilen farelerin akciğeri, soldaki Araç grubuna kıyasla yüksek NF-κB boyaması gösterdi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Temsili western blot, CSD ile tedavi edilen farelerin akciğerde artmış bir NF-κB ekspresyonuna sahip olduğunu gösterdi. Taze akciğer dokusu lizisi western blotlamaya tabi tutuldu. (C) Sil ve Veh grupları arasındaki NF-κB farkı anlamlıydı (** P < 0.01). Bant yoğunluğu Resim J kullanılarak ölçülmüştür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Silikoz fare modelleri, silikozun patogenezini ve tedavisini incelemek için çok önemlidir. Bu protokol, tekrarlanan nazal maruziyet yoluyla farelerde bir silikoz modeli hazırlamak için bir yöntemi açıklar. Bu yöntem, farklı maruz kalma sürelerinin neden olduğu silikozun patolojik özelliklerinin incelenmesine izin verir. Fareler ventilatörde uyuşturuldu ve solunum hızları izlendi. Başlangıçtaki kısa, hızlı solunum hızı zamanla yavaş yavaş yavaşladı ve derinleşti. Anestezi, farelerin kaslarının gevşemesine neden oldu, derin nefes almaya yol açtı ve yavaş, derin nefes alma süresi boyunca CSD'yi solumalarına izin verdi. Bu işlem sırasında operatör, farenin mandibulasını başparmağıyla tutar ve sıvının sindirim sistemine girmesini önlemek için boynunu düzeltir, bu da ağrıya neden olmayan ve invaziv olmayan solunabilir toza maruz kalma yöntemidir. Bu yöntem, toza maruz kalmayı incelemek için tekrarlanan uygulamanın bireysel ihtiyaçlarını karşılayabilir. Kato ve ark. 2017 yılında pulmoner fibrozu modellemek için bir orofaringeal damla yoluyla tek bir büyük doz (125 mg / mL, 40 μL) kullandı ve burun boşluğu boyunca birden fazla küçük dozun neden olduğu pulmoner değişiklikleri keşfetmeye çalışmak için bu konsantrasyona atıfta bulunuyoruz14.
Anestezi sonrası burun damlaları ile ilgili teknik açıdan çeşitli zorluklar vardır. Bu işlem sırasında operatör, boynunu düzeltmek ve sıvının sindirim sistemine girmesini önlemek için farenin mandibulasını başparmağıyla tutar. Fareler derin anestezi sağlamazsa veya operatör yetenekli değilse ve yavaş derin nefes alma için zaman penceresini kaçırırsa, burun akıntısının etkisi ve modelin patolojik özellikleri beklendiği gibi olmayacaktır. Bu nedenle, aşırı anestezi uygulanmış ölüm ve yetersiz anestezi uygulanmış modelleme başarısızlığından kaçınmak için, izofluran anestezi uygulanmış farelerle çalışanlar, burun damlaması yapmadan önce yeterince eğitilmeli ve izofluran anestezi uygulanmış farelerin kritik özelliklerine hakim olmalıdır. Ayrıca, yaygın olarak masaj olarak adlandırılan burun akıntısından sonra farelerin göğsüne bastırmak, CSD'nin terminal bronşlara ve hatta akciğerlerin alveolar duvarlarına ulaşmasını teşvik eder. Derin bir seviyeye kadar anestezi uygulanan fareler, yüksek dozda burun damlası aldıklarında boğulmaya eğilimliydi. Bununla birlikte, göğüsleri hızla sıkıştırılırsa, hayatta kalma oranı artar. Son olarak, silikoz modellerinin oluşturulması, sağlam bir fiziksel temele sahip fareler gerektirir ve bazı çalışmalar, 10-12 haftalıktan büyük farelerin CSD'ye tekrar tekrar maruz kaldıktan sonra zayıf toleransa ve artan ölüm oranına sahip olduğunu göstermiştir. Avantajlarına rağmen, bu modelin birkaç dezavantajı vardır. Bir dezavantajı, farenin hava akışı yoluyla toz parçacıklarını doğrudan solumamasıdır. Bu sorunu çözmek için, tek bir nefeste solunan CSD süspansiyon miktarını ve CSD'nin tekrarlanan uygulama sıklığını sınırladık. Ayrıca araç grupları oluşturduk. Veriler, az miktarda sıvının solunmasının ventilasyonu yalnızca geçici olarak bozduğunu ve bunun farelerin akciğerlerine zarar vermeyeceğini ortaya koymaktadır12. Araç kontrol fareleri, farelerin akciğer fonksiyonunu, vücut ağırlığını veya bazal aktivitesini etkilemeden solunan salin sıvısını hızla emecektir. Aksine, burun inhalasyonu yoluyla CSD'ye tekrar tekrar maruz kalmak, farelerde istenen dinamik silikoz modelini yaratabilir12. Tekrarlanan maruziyetlerin olduğu modellerde farklı maruziyet frekansları fibroz sürecini etkilediği için net bir zaman noktamız yok. Genellikle, bir kerelik silika tozuna maruz kalmak için, 7. gün hala silikozun erken aşamalarındadır. 7-14. günler inflamatuar aktivite aşamasına, 14-28. günler fibroz transformasyon aşamasına ve 28. günden sonraki süre fibroz oluşum aşamasına 12,15'e karşılık gelir. Bununla birlikte, bu zaman noktalarındaki patoloji doza bağlı olarak değişebilir.
Burun akıntısı yönteminin, trakeotomi ile ilişkili enfeksiyonların azaltılması ve postoperatif bakım gibi geleneksel endotrakeal damlamalara veya cerrahi olarak maruz kalan trakeostomi yaklaşımlarına16,17 göre çeşitli avantajları vardır. Bu yaklaşım aynı zamanda bir deney sırasında tekrarlanan CSD'ye maruz kalma gereksinimini de karşılayabilir ve pahalı ekipman gerektirmez. Ek olarak, burun damlası yöntemi, küçük parçacıklar üst solunum yolundan akciğerlere girip terminal bronşiyollere ve alveollere gittiğinden, toza maruz kalmanın daha gerçekçi bir temsilidir. Birden fazla küçük dozda silika damlası kullandığımızdan, silika tozu dozu akciğere maksimum ölçüde girebilir ve organizmayı sürekli olarak uyarabilir. Bu nedenle, bu modelleme yaklaşımı, çalışanların çalışma ortamlarında CS'ye tekrarlayan maruziyetini simüle etmek ve silikozisin patolojik sürecini araştırmak için geliştirilmiştir.
CSD'ye nazal maruziyet yoluyla fare silikoz modelleri oluşturmak, tekrarlanan maruziyetlere uygulanabilir. Bu nedenle, bu hayvan modeli, maruziyet sıklığının ve dozlamanın silikoz ilerlemesi üzerindeki etkilerini ve silikozun dinamik patolojik özelliklerini ve mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, diğer maddeler veya ilaçlarla kombine maruziyet de çok mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Anhui Eyaleti Üniversite Sinerji İnovasyon Programı (GXXT-2021-077) ve Anhui Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Lisansüstü İnovasyon Fonu (2021CX2120) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL tube | Biosharp | BS-05-M | |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | NA | |
| Adobe Illustrator | Adobe | NA | |
| Alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | NA | |
| CD68 | Abcam | ab125212 | |
| Citrate antigen retrieval solution | biosharp life science | BL619A | |
| DAB chromogenic kit | NJJCBio | W026-1-1 | |
| Dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| Enhanced BCA protein assay kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | Sa00001-2 | |
| Iceacetic acid | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | NA | |
| ImageJ | NIH | NA | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| Masson's Trichrome stain kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | NA | |
| Microtubes | Millipore | AXYMCT150CS | |
| NF-κB p65 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | NA | |
| Paraffin embedding machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | NA | |
| Phosphate buffer (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | NA | |
| Pipettes | Eppendorf | NA | |
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| Prism7.0 | GraphPad | Version 7.0 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA lysis buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | NA | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxid | Sigma | #BCBV6865 | |
| Sirius red staining | Nanjing SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd. | 181012 | |
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips (0.1–10 µL) | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips (100–1000 µL) | KIRGEN | KG1313 | |
| Universal Pipette Tips (1–200 µL) | KIRGEN | KG1212 | |
| Vortex mixer | VWR | NA | |
| ZEISS GeminiSEM 500 | Zeiss Germany | SEM 500 | |
| β-actin | Bioss | bs-0061R |
References
- Olsson, A., Kromhout, H. Occupational cancer burden: the contribution of exposure to process-generated substances at the workplace. Molecular Oncology. 15 (3), 753-763 (2021).
- The Lancet Respiratory. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283 (2019).
- Weissman, D. N. Progressive massive fibrosis: An overview of the recent literature. Pharmacology & Therapeutics. 240, 108232 (2022).
- Lancet, C. C., Yu, I. T., Chen, W.
- Mazurek, J. M., Wood, J., Blackley, D. J., Weissman, D. N. Coal workers' pneumoconiosis-attributable years of potential life lost to life expectancy and potential life lost before age 65 years - United States, 1999-2016. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (30), 819-824 (2018).
- Voelker, R. Black Lung resurgence raises new challenges for coal country physicians. JAMA. 321 (1), 17-19 (2019).
- Nakashima, K., et al. Regulatory role of heme oxygenase-1 in silica-induced lung injury. Respiratory Research. 19 (1), 144 (2018).
- Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251 (2022).
- Salehi, F., et al. Immunological responses in C3H/HeJ mice following nose-only inhalation exposure to different sizes of beryllium metal particles. Journal of Applied Toxicology. 29 (1), 61-68 (2009).
- Yang, T., et al. Emodin suppresses silica-induced lung fibrosis by promoting Sirt1 signaling via direct contact. Molecular Medicine Reports. 14 (5), 4643-4649 (2016).
- Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Mu, M., et al. Coal dust exposure triggers heterogeneity of transcriptional profiles in mouse pneumoconiosis and Vitamin D remedies. Particle and Fibre Toxicology. 19 (1), 7 (2022).
- Kato, K., et al. Muc1 deficiency exacerbates pulmonary fibrosis in a mouse model of silicosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 493 (3), 1230-1235 (2017).
- Liu, F., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells depletion may attenuate the development of silica-induced lung fibrosis in mice. PLoS One. 5 (11), 15404 (2010).
- Mansouri, N., et al. Mesenchymal stromal cell exosomes prevent and revert experimental pulmonary fibrosis through modulation of monocyte phenotypes. JCI Insight. 4 (21), 128060 (2019).
- Ohtsuka, Y., Wang, X. T., Saito, J., Ishida, T., Munakata, M. Genetic linkage analysis of pulmonary fibrotic response to silica in mice. The European Respiratory Journal. 28 (5), 1013-1019 (2006).
