Dissection de tissu pancréatique pour isoler des cellules uniques viables
Summary
Les cellules métaplasiques pancréatiques sont des précurseurs de cellules malignes à l’origine des tumeurs pancréatiques. Cependant, il est difficile d’isoler des cellules pancréatiques viables intactes. Nous présentons ici une méthode efficace de dissociation du tissu pancréatique. Les cellules peuvent ensuite être utilisées pour le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ou pour la co-culture bidimensionnelle ou tridimensionnelle.
Abstract
Le pancréas comprend deux systèmes principaux : le système endocrinien, qui produit et sécrète des hormones, et le système exocrinien, qui représente environ 90 % du pancréas et comprend des cellules qui produisent et sécrètent des enzymes digestives. Les enzymes digestives sont produites dans les cellules acineuses pancréatiques, stockées dans des vésicules appelées zymogènes, et sont ensuite libérées dans le duodénum via le canal pancréatique pour initier des processus métaboliques. Les enzymes produites par les cellules acineuses peuvent tuer les cellules ou dégrader l’ARN acellulaire. De plus, les cellules acineuses sont fragiles et les protocoles de dissociation courants entraînent un grand nombre de cellules mortes et de protéases et de RNases acellulaires. Par conséquent, l’un des plus grands défis de la digestion des tissus pancréatiques est de récupérer des cellules intactes et viables, en particulier les cellules acineuses. Le protocole présenté dans cet article montre une méthode en deux étapes que nous avons développée pour répondre à ce besoin. Le protocole peut être utilisé pour digérer un pancréas normal, un pancréas qui comprend des lésions précancéreuses ou des tumeurs pancréatiques qui comprennent un grand nombre de cellules stromales et immunitaires.
Introduction
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’un des types de cancer les plus agressifs1. Les preuves cliniques soutiennent l’idée que la PDAC se développe à partir de cellules du système exocrinien, y compris les cellules acineuses, sur de nombreuses années, sous l’effet de mutations dans le proto-oncogène2 KRAS.
Les tumeurs pancréatiques comprennent de nombreux types de cellules différentes, et il a été démontré que les cellules malignes ne représentent que 20 à 50 % de la masse tumorale3. Différents types de cellules interagissent avec les cellules épithéliales, soutiennent leur transformation et améliorent la formation et la croissance des tumeurs. Les événements précoces provoquent une métaplasie acineuse, qui donne lieu à des lésions microscopiques appelées néoplasie intraépithéliale pancréatique (PanINs), qui peuvent dans certains cas évoluer en PDAC4.
Il est essentiel d’étudier ces interactions et de cibler les signaux pivots. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) est une méthode puissante qui révèle l’expression des gènes à une résolution unicellulaire, permettant ainsi de suivre les changements subis par les cellules épithéliales, permettant ainsi d’explorer le développement du cancer du pancréas.
La dissection tissulaire et la digestion de cellules individuelles constituent la première étape d’une expérience de séquençage de l’ARNsc. Plusieurs facteurs rendent la digestion des tissus pancréatiques particulièrement difficile : i) les cellules acineuses représentent plus de 90 % du pancréas et les cellules acineuses contiennent de grandes quantités d’enzymes digestives, y compris des protéases et des RNases qui réduisent la qualité des banques à base d’ARN ; (ii) les cellules acineuses sont très sensibles et peuvent se lyser si des protocoles standard sont utilisés ; (iii) les cellules acineuses expriment un petit nombre de gènes à des niveaux très élevés. Par conséquent, si ces cellules sont lysées au cours de l’expérience, cela peut contaminer le profil d’expression génique observé d’autres cellules ; (iv) le tissu pancréatique récupéré des tumeurs est desmoplastique, ce qui le rend difficile à disséquer sans endommager les cellules. Ainsi, même s’il est nécessaire de maintenir une viabilité élevée de tous les types de cellules, le grand nombre et la sensibilité des cellules acineuses ajoutent une complexité supplémentaire. Ces facteurs imposent des difficultés à obtenir une suspension unicellulaire viable à plus de 80 % et sans amas, comme c’est le cas pour les expériences de scRNA-seq.
Ici, nous avons développé un protocole utilisant la trypsine C et la collagénase P, ainsi qu’une surveillance fréquente des tissus. Cela favorise la dissociation en cellules uniques tout en conservant une viabilité élevée pour soutenir le succès des expériences de scRNA-seq 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous vous présentons un protocole de dissociation du tissu pancréatique. Le protocole est simple, facile à utiliser et fournit un outil pour isoler des cellules uniques viables du tissu pancréatique à différents stades du processus de malignité, y compris les tumeurs solides. Dans des études antérieures, différents types de collagénases ont été utilisés pour digérer le pancréas 8,9. L’utilisation d’une collagénase très puis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier la Dre Avital Sarusi-Portuguez pour son aide dans l’analyse des données et la Dre Dror Kolodkin-Gal pour son aide dans l’établissement du protocole dans le cadre d’une étude précédente. Nous remercions tous les membres passés et présents du laboratoire Parnas. Nous remercions la Dre Gillian Kay et le Dr Michael Kanovsky pour leur aide dans la révision. Ce projet a reçu un financement de la Fondation israélienne pour la science (n° 526/18 O.P.), du programme Alex U. Soyka et d’une subvention du Fonds israélien de recherche sur le cancer (prix de développement de carrière en recherche).
Materials
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
Referências
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