Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung von DNA-Schadensreparaturproteinen in von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden. Dazu gehören umfassende Plattierungs- und Färbemethoden sowie detaillierte, objektive Quantifizierungsverfahren.
Abstract
Die Immunfluoreszenz ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur Visualisierung von Zielantigenen mit hoher Sensitivität und Spezifität, die die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Proteinen, Glykanen und kleinen Molekülen ermöglicht. Während diese Technik in der zweidimensionalen (2D) Zellkultur gut etabliert ist, ist weniger über ihre Verwendung in dreidimensionalen (3D) Zellmodellen bekannt. Ovarialkarzinom-Organoide sind 3D-Tumormodelle, die die klonale Heterogenität von Tumorzellen, die Tumormikroumgebung sowie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen rekapitulieren. Damit sind sie Zelllinien bei der Bewertung von Wirkstoffsensitivität und funktionellen Biomarkern überlegen. Daher ist die Fähigkeit, Immunfluoreszenz an primären Ovarialkarzinom-Organoiden zu verwenden, äußerst vorteilhaft für das Verständnis der Biologie dieses Krebses. Die aktuelle Studie beschreibt die Technik der Immunfluoreszenz zum Nachweis von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in hochgradigen serösen, von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden (PDOs). Nachdem die PDOs ionisierender Strahlung ausgesetzt wurden, wird eine Immunfluoreszenz an intakten Organoiden durchgeführt, um Kernproteine als Herde zu bewerten. Die Bilder werden mit Hilfe der Z-Stack-Bildgebung auf konfokaler Mikroskopie gesammelt und mit einer automatisierten Herdzählsoftware analysiert. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Analyse der zeitlichen und speziellen Rekrutierung von DNA-Schadensreparaturproteinen und die Kolokalisation dieser Proteine mit Zellzyklusmarkern.
Introduction
Eierstockkrebs ist die häufigste Todesursache aufgrund gynäkologischer Malignität. Die Mehrzahl der Patienten wird mit DNA-schädigenden Medikamenten wie Carboplatin behandelt, und Patienten mit Tumoren mit homologer Rekombinationsreparatur (HRR) können Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) -Inhibitoren 1,2 verabreicht werden. Die meisten Patienten entwickeln jedoch eine Resistenz gegen diese Therapien und sterben innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose. Eine Dysregulation der DNA-Schadensantwort (DDR) wurde mit der Entwicklung von Eierstockkrebs und sowohl Chemotherapie als auch PARP-Inhibitor-Resistenz in Verbindung gebracht3. Daher ist die Untersuchung der DDR unerlässlich, um die Pathophysiologie von Eierstockkrebs, potenzielle Biomarker und neuartige zielgerichtete Therapien zu verstehen.
Aktuelle Methoden zur Bewertung der DDR verwenden Immunfluoreszenz (IF), da dies die genaue Identifizierung und Lokalisierung von DNA-schädigenden Proteinen und Nukleotidanaloga ermöglicht. Sobald es einen Doppelstrangbruch (DSB) in der DNA gibt, wird das Histonprotein H2AX schnell phosphoryliert und bildet einen Fokus, in dem sich DNA-Schadensreparaturproteine versammeln4. Diese Phosphorylierung kann leicht mit Hilfe von IF identifiziert werden; Tatsächlich wurde der ɣ-H2AX-Assay üblicherweise verwendet, um die Induktion eines DSB 5,6,7,8,9 zu bestätigen. Erhöhte DNA-Schäden wurden mit der Platinsensitivität und Wirksamkeit von DNA-schädigenden Stoffen in Verbindung gebracht 10,11,12, und ɣ-H2AX wurde als Biomarker vorgeschlagen, der mit dem Ansprechen auf eine Chemotherapie bei anderen Krebsbehandlungen assoziiert ist 13. Bei einem DSB führt eine Zelle, die HRR beherrscht, eine Reihe von Ereignissen durch, die dazu führen, dass BRCA1 und BRCA2 RAD51 rekrutieren, um das Replikationsprotein A (RPA) zu ersetzen und an die DNA zu binden. Bei der HRR-Reparatur wird eine DNA-Vorlage verwendet, um das DSB originalgetreu zu reparieren. Wenn Tumoren jedoch einen Mangel an HRR aufweisen, sind sie auf alternative Reparaturwege wie die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) angewiesen. Es ist bekannt, dass NHEJ fehleranfällig ist und eine hohe Mutationslast für die Zelle erzeugt, die 53BP1 als positiven Regulator verwendet14. Diese DNA-schädigenden Proteine können alle mit Hilfe von IF genau als Herde identifiziert werden. Zusätzlich zur Färbung von Proteinen kann IF verwendet werden, um den Gabelschutz und die Bildung einzelsträngiger DNA-Lücken zu untersuchen. Die Fähigkeit, stabile Gabeln zu haben, wurde mit dem Ansprechen von Platin korreliert, und in jüngster Zeit haben Gap-Assays das Potenzial gezeigt, das Ansprechen auf PARP-Inhibitoren 6,15,16,17 vorherzusagen. Daher ist die Färbung der Nukleotidanaloga nach der Einführung in das Genom eine weitere Möglichkeit, die DDR zu untersuchen.
Bisher war die Bewertung der DDR bei Ovarialkarzinomen weitgehend auf homogene 2D-Zelllinien beschränkt, die die klonale Heterogenität, Mikroumgebung oder Architektur von In-vivo-Tumoren nicht rekapitulieren18,19. Neuere Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass Organoide 2D-Zelllinien bei der Untersuchung komplexer biologischer Prozesse wie DDR-Mechanismen überlegen sind6. Die vorliegende Methodik bewertet RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA und Geminin in PDOs. Diese Methoden beurteilen das intakte Organoid und ermöglichen die Untersuchung von DDR-Mechanismen in einer Umgebung, die der Mikroumgebung des In-vivo-Tumors ähnlicher ist. Zusammen mit der konfokalen Mikroskopie und der automatisierten Herdzählung kann diese Methodik dazu beitragen, den DDR-Signalweg bei Eierstockkrebs zu verstehen und Behandlungspläne für Patienten zu personalisieren.
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Protocol
Tumorgewebe und Aszites wurden nach Einholung der Zustimmung der Patientin im Rahmen eines gynäkologischen Onkologie-Biorepositorys gewonnen, das vom Institutional Review Board (IRB) der Washington University in St. Louis zugelassen wurde. Es wurden Patienten eingeschlossen, die einen hochgradigen serösen Ovarialkarzinom (HGSOC) im fortgeschrittenen Stadium hatten. Alle Eingriffe wurden bei Raumtemperatur auf der Werkbank durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle Reagenzien wurden bei Raumtemperatur (sofern nicht anders angegeben) hergestellt und bei 4 °C gelagert.
1. Organoid-Erzeugung
- Generieren Sie die Organoide gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht20.
2. Beschichtung und Bestrahlung von Organoiden
- Verwenden Sie Organoide in Kultur, entfernen Sie die Laschen der Organoide aus der Kulturschale durch manuelle Manipulation einer Pipettenspitze. Sammeln Sie die Organoide in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 1.650 x g für 5 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette vorsichtig ab.
- Fügen Sie dem Pellet 1.000 μl eines rekombinanten Enzyms tierischen Ursprungs hinzu (siehe Materialtabelle). Die Lösung wird gemischt und 15 min bei 37 °C inkubiert.
- Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.650 x g für 5 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette vorsichtig ab.
- Nach Zentrifugation und Aspiration resuspendieren Sie das Pellet in 1.000 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
- 10 μl der Lösung werden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und mit 10 μl Trypanblau gemischt.
- 10 μl der Trypanblau-Zelllösung werden in einen Objektträger der Zellzählkammer gegeben und in die Zellzählmaschine eingeführt (siehe Materialtabelle).
- 40.000 Zellen pro 20 μl Basalmembranextrakt (BME) in einen 8-Well-Glaskammerobjektträger geben (siehe Materialtabelle). Dadurch bleiben die Organoide 3-5 Tage lang erhalten, damit die Zellen Organoide bilden und auf eine geeignete Größe wachsen können.
- Um Doppelstrang-DNA-Brüche zu induzieren, bestrahlen Sie die plattierten Organoide mit 10 Gray (Gy) ɣ-Bestrahlung (siehe Materialtabelle für Details zur Bestrahlung).
HINWEIS: Dies kann bis zu 5-10 Minuten dauern. - Inkubation der Organoide in ihren Nährmedien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 für 4 h.
3. Immunfluoreszenzfärbung
HINWEIS: Die Volumina beziehen sich auf die Menge pro Well des 8-Well-Kammerobjektträgers (~300 μl).
- Nach Bestrahlung und Inkubation der Organoide saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette ab, um die 3D-Matrix nicht zu stören. Mit 300 μl PBS waschen.
- Fixieren Sie die Organoide in 300 μl 2% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min.
HINWEISE: Nicht zu lange stehen lassen, da der BME depolymerisiert und abgesaugt werden könnte. - Waschen Sie die Organoide mit 300 μl Färbepuffer (siehe Materialtabelle). 5 Minuten auf einen Shaker geben.
- Für die Permeabilisierung vorsichtig 300 μl Permeabilisierungspuffer (siehe Materialtabelle) zugeben und 20 min inkubieren. Mit 300 μl Färbepuffer waschen. 5 Minuten auf einen Shaker geben.
- Fügen Sie 300 μl Färbepuffer hinzu, um den Permeabilisierungsschritt zu blockieren. 30 Minuten auf einen Shaker geben. Saugen Sie den Färbepuffer mit einer Pipette ab.
- 300 μl Primärantikörper (Kaninchen-Anti-RAD51, Maus-Anti-Geminin, Kaninchen-Anti-RPA, Maus-Anti-ƔH2AX, Kaninchen-Anti-Geminin, Maus-Anti-53BP1; siehe Materialtabelle) werden in Färbepuffer verdünnt. Bei 4 °C 16 h inkubieren.
HINWEIS: Vermeiden Sie eine Co-Färbung mit demselben Wirtstier. Lassen Sie den Deckel geschlossen, um zu vermeiden, dass sich die Antikörper in benachbarte Vertiefungen mischen. - Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung. Führen Sie drei Wäschen mit 300 μl Färbepuffer für jeweils 5 Minuten auf dem Shaker durch.
- 300 μl Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Maus-Alexa-Fluor 488 und Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor 647; siehe Materialtabelle) in Färbepuffer verdünnte Lösung zugeben und 1 h im Dunkeln inkubieren.
HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte müssen im Dunkeln ausgeführt werden. - Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung. Fügen Sie 300 μl verdünntes DAPI hinzu. 5 Minuten auf einen Shaker geben.
- Führen Sie drei Wäschen mit 300 μl Färbepuffer für jeweils 5 Minuten auf dem Shaker durch. Entfernen Sie den Färbepuffer und lösen Sie die Kammern mit dem Entnahmeset, das den Objektträgern beiliegt (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie nicht zu weit nach vorne drücken, um die 3D-Matrix zu stören. - Fügen Sie mit einer p200-Pipettenspitze mit abgeschnittener Spitze Einlagemedium hinzu (siehe Materialtabelle), um jede Vertiefung mit einer Organoidlasche abzudecken (z. B. 20-30 μl für jede Organoidlasche).
- Legen Sie ein Deckglas über die Probe, um Blasen zu vermeiden.
- Nehmen Sie durchsichtigen Nagellack und malen Sie ihn auf die Seiten des Deckglases, um den Objektträger zu versiegeln. 1 h aushärten lassen und bei -20 °C platzieren.
HINWEIS: Nach der Bildgebung kann der Objektträger mindestens 6 Monate mit minimalem Fluoreszenzverlust gelagert werden.
4. Bildgebung
- Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle) bei 63-fachem Objektiv mit Immersionsöl auf.
HINWEIS: Bei der Abbildung von Kernproteinen ist 63x vorteilhaft, aber 40x ist auch akzeptabel. - Verwenden Sie DAPI, um die Organoide durch das Okular zu lokalisieren. Wählen Sie die geeigneten Filter für die Mikroskopie basierend auf den verwendeten Fluorophoren aus. Legen Sie die Parameter für die Erfassung der Z-Stack-Images fest.
HINWEIS: Die in der Studie verwendeten Fluorophore waren DAPI, 488 und 647. Die Laser 405, 488 und 638 wurden eingeschaltet, um die Färbung zu visualisieren.
HINWEIS: Der empfohlene Z-Stack hängt vom Auflösungsvermögen des Objektivs ab. - Passen Sie das Livebild an: Stellen Sie Fokus, Laserintensität usw. ein.
HINWEIS: Je höher die Laserintensität, desto wahrscheinlicher ist es, dass die Probe photobleichen wird. Wählen Sie daher eine optimale Laserintensität. - Erwerben Sie den Z-Stack.
HINWEIS: Dies kann bis zu 5-10 Minuten dauern. - Machen Sie aus den im Z-Stapel gesammelten Bildern mindestens drei Bilder pro Stapel.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie Screenshots im gesamten Stapel erhalten, um die Kerne bei der Quantifizierung nicht zu duplizieren. - Speichern Sie jede Datei als TIFF und fahren Sie mit der Analyse fort (Schritt 5).
5. Würdigung
HINWEIS: Verwenden Sie JCountPro für alle Bildanalysen nach dem zuvor veröffentlichten Bericht21. Um diese Software zu erhalten, verweisen Sie auf die zugehörige Publikation.
- Wählen Sie im Bereich "Objektanalyse" (oben im Programm) auf der Registerkarte "Dateiauswahl" (unten im Programm) die TIFF-Dateien aus.
- Klicken Sie auf Hinzufügen , um die ausgewählten Dateien in die Gruppe der ausgewählten Dateien zu verschieben. Wählen Sie Anzeige aus.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Segmentierung Blau als Farbe der Kerne aus. Wählen Sie Automatische Segmentierung , um den Schwellenwert der Kerne zu optimieren.
HINWEIS: Wenn die automatische Segmentierung die Objekte nicht genau identifiziert, kann der Benutzer die Feinabstimmung und die Rohabstimmung an das Bild anpassen oder das Benutzerhandbuch einsehen, um die Segmentierung weiter zu optimieren. - Wählen Sie im Objektbereich die Option Große Objekte automatisch aufteilen und die Größe der Kerne optimieren.
Hinweis: Die Kerne haben in der Regel eine unbedingte Größe von 5.000 Pixeln, während die bedingte Größe 1.500 Pixel beträgt. Lesen Sie das Benutzerhandbuch, um die Größe der Objekte weiter zu optimieren. - Wählen Sie Objekte identifizieren aus, um die Parameter zu testen.
HINWEIS: Wenn diese Parameter nicht genau sind, können Größe und Abstimmung zusammen mit anderen Einstellungen angepasst werden. Im Benutzerhandbuch finden Sie Anweisungen zur weiteren Optimierung. - Nachdem Sie die Parameter an das Bild angepasst haben, wählen Sie Objekte in allen Bildern identifizieren, um die Kerne in allen ausgewählten Bildern zu identifizieren .
- Wählen Sie das Bedienfeld "Fokusanalyse" (oben im Programm) aus.
- Wählen Sie auf der Registerkarte Dateien auswählen (unten im Programm) die TIFF-Dateien aus, die für die Objektanalyse verwendet wurden, und klicken Sie auf die Pfeilschaltflächen (>>), um die Bilder in die Gruppe Bilddateien zu verschieben.
- Doppelklicken Sie in der Verzeichnisgruppe unter den verschobenen Bilddateien auf den Ordner Manuelle Bearbeitung , und wählen Sie aus, ob die IOC-Dateien in die Gruppe Objektsammlungsdateien verschoben werden sollen.
HINWEIS: Alle ausgewählten TIFFs müssen mit den IOC-Dateien übereinstimmen. - Klicken Sie auf Auswählen , um die Dateien in die ausgewählte Dateigruppe zu verschieben. Wählen Sie die Registerkarte Foci-Zählung am unteren Rand des Programms.
- Optimieren Sie die Parameter, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Index der Zylindereinstellungen: 12.
- Fokuskanal: Wählen Sie die Farbe der Brennpunkte (grün: ɣ-H2AX; rot: RAD51).
- H-Kuppeleinstellungen: Kuppelhöhe %: 30; Schwellenwert %: 28 und 28.
- Form-/Größeneinstellung: Minimale Fokusgröße, Pixel: 5. Wählen Sie Form/Größe anwenden. Maximale Fokusgröße (bedingt): 32. Minimale Rundheit, x100: 96. Max. Fokus, Pixel: 60.
- Rauschfilter: Größe 1.
HINWEIS: Wenn Sie feststellen, ob ein Kern positiv für die Gemininfärbung ist, wählen Sie unter dem zweiten Kanal Grün und unter Analyse die Intensität aus.
- Um die eingestellten Parameter zu testen, wählen Sie die folgenden Schaltflächen in der angegebenen Reihenfolge aus: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
HINWEIS: Wenn diese Parameter nicht funktionieren, können Größe und Abstimmung zusammen mit anderen Einstellungen angepasst werden. Lesen Sie das Benutzerhandbuch, um mehr darüber zu erfahren, wie das Bild weiter optimiert werden kann. - Sobald die Parameter für die ausgewählten Bilder optimiert sind, wählen Sie Automatische Zählung , um die Brennpunkte in jedem Bild pro Kern zu zählen. Wenn der zweite Kanal gewünscht wird, bestimmt das Programm die Intensität, die verwendet werden kann.
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Representative Results
Das vorgestellte Protokoll kann erfolgreich Proteine zur Reparatur von DNA-Schäden in Organoiden färben, visualisieren und quantifizieren. Diese Technik wurde verwendet, um PDOs sowohl vor als auch nach der Bestrahlung zu färben und zu bewerten. PDOs wurden 10 Gy Strahlung ausgesetzt und auf die folgenden Biomarker untersucht: ɣ-H2AX (Abbildung 1), ein Marker für DNA-Schäden; RAD51 (Abbildung 2), ein Marker für HRR; 53BP1, ein Marker für NHEJ; RPA, ein Marker für Replikationsstress (Abbildung 3); und Geminin, ein G2/S-Phasen-Zellzyklusmarker14. Die Dosis von 10 Gy wurde auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Forschungsergebnisse gewählt, die DNA-Schäden bei Eierstockkrebs untersuchten 6,22. Die JCountPro-Software wurde verwendet, um den Kern zu identifizieren und die Anzahl der Herde innerhalb des Kerns mit den dargestellten Parametern13 zu quantifizieren (Abbildung 4). Die Software identifiziert den Zellkern (Abbildung 4A, B), dann die Kernherde (Abbildung 4C) und filtert die Herde von Geminin-positiven Zellen (Abbildung 4D).
Abbildung 1: ɣ-H2AX-Herde in PDOs vor und nach der Bestrahlung. Repräsentative Bilder von DAPI- und ɣ-H2AX-Brennpunkten in PDOs vor und nach der Bestrahlung bei 10x mit 63x Einsätzen. Maßstabsbalken: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: RAD51-Herde und Geminin in PDOs vor und nach der Bestrahlung. Repräsentative Bilder von DAPI, Geminin, RAD51 und Co-Färbung von Geminin/RAD51-Foci PDOs vor und nach der Bestrahlung bei 10x mit 63x Einsätzen. Maßstabsbalken: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: RPA und 53BP1 in PDOs vor und nach der Bestrahlung. Repräsentative Bilder von (A) DAPI, RPA; (B) Geminin, 53BP1 und Co-Färbung von Geminin/53BP1-Foci bei 10x mit 63x Einsätzen. Maßstabsbalken: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Der Quantifizierungs-Workflow der JCountPro-Software. (A) Bei der Objektanalyse wird der blaue Kanal ausgewählt, um die blauen Objekte und Kerne zu identifizieren, und dann automatisch optimiert, indem die automatische Segmentierung ausgewählt wird (roter Pfeil). (B) Bei der automatischen Aufteilung wird die Objektgröße (Kerne) an die Größe des Bildes und die Vergrößerung angepasst. Die Schaltfläche Objekt identifizieren wird ausgewählt, um die Parameter zu testen (1), und die Schaltfläche Objekte in allen Bildern identifizieren (roter Pfeil) wird ausgewählt, um Objekte (Kerne) für jedes Bild zu identifizieren. (C) Auf der Registerkarte Fokusanalyse werden die Bilder eingegeben und die Parameter für die Brennpunktzählung festgelegt: Zuerst wird die Farbe der Brennpunkte unter dem Fokuskanal grün ausgewählt. Der Top Hat Index ist auf 12 eingestellt. Die H-Dome-Einstellungen sind so eingestellt, dass sie einen Kuppelhöhenprozentsatz von 30 und einen Schwellenwertprozentsatz von 28 haben. Die Form und Größe der Brennpunkte werden auf die Bildgröße mit den manuellen Parametern maximaler Fokusgröße Pixel bei 60 und minimaler Rundheit x 100 bei 96 optimiert; Zum Schluss wird der Rauschfilter angewendet. Die Einstellungen werden getestet, indem der Zylinder, die H-Kuppel und die Anzahl der Brennpunkte (1-3) angewendet werden. Um die ɣ-H2AX-Herde pro Zelle zu quantifizieren, drücken Sie Start (roter Pfeil). (D) Für die RAD51-Brennpunkte werden die Einstellungen wie für ɣ-H2AX-Brennpunkte dargestellt angewendet, mit Ausnahme des Fokuskanals, der auf Rot geändert wird. Um jedoch Kerne zu identifizieren, die mit Geminin gefärbt sind, wird der zweite Kanal für Grün ausgewählt und die Analyse wird auf Intensität geändert. Die Parameter werden getestet, indem der Zylinder, die H-Kuppel und die Anzahl der Brennpunkte (1-3) angewendet werden, dann Start (roter Pfeil) gedrückt wird, um alle RAD51-Brennpunkte zu quantifizieren und die Intensität des Grüns pro Zelle in jedem Bild zu bewerten. Maßstabsleiste: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die DNA-Schadensantwort spielt eine wesentliche Rolle sowohl bei der Entwicklung von Eierstockkrebs als auch bei der Chemotherapieresistenz. Daher ist ein gründliches Verständnis der DNA-Reparaturmechanismen unerlässlich. Hier wird eine Methodik vorgestellt, um DNA-Schadensreparaturproteine in intakten 3D-Organoiden zu untersuchen. Es wird ein reproduzierbares, zuverlässiges Protokoll entwickelt, das charakteristische Antikörper verwendet, um DNA-Schäden, homologe Rekombination, nicht-homologe Endverbindungen und Replikationsstress zu bewerten. Wichtig ist, dass diese Methoden mit genetisch veränderten Kontrollen validiert werden, die die Spezifität und Sensitivität dieser Methoden demonstrieren.
Der kritischste Schritt in diesem Protokoll ist die Beschichtung und Fixierung der Organoide. Dieses Protokoll inkubiert spezifisch Organoide in 2% PFA für 10 Minuten unter engmaschiger Überwachung des Basalmembranextrakts (BME) während des Fixierungsprozesses. Dies unterscheidet sich von anderen Immunfluoreszenzprotokollen in Organoiden, die die Verwendung von 4% PFA für 10-60 min23,24,25 vorschlagen. Es wurde festgestellt, dass, wenn die Tabs des BME zu lange in einer konzentrierten Menge PFA sind, die Tabs depolymerisieren und einer Aspiration unterliegen. Bemerkenswert ist, dass Hersteller bestimmter BMEs häufig Vorschläge zur Fixierung machen. Ein weiterer wichtiger Diskussionspunkt ist die Beschichtung der Organoide. Der Färbeprozess kann dazu führen, dass ein Teil oder alle Organoide verloren gehen. Je konfluenter die Lasche zum Zeitpunkt der Beschichtung ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Probe den Färbeschritten erfolgreich standhält.
Zu den Stärken dieses Protokolls gehören die Validierung der Färbung von Kernantikörpern, die Fähigkeit zur Durchführung von Immunfluoreszenz und Bildgebung von intakten 3D-Organoiden sowie die Anpassungsfähigkeit des Protokolls an jede Behandlung oder jedes Molekül von Interesse.
Die in diesen Experimenten verwendeten Antikörper wurden mit genetisch veränderten Eierstockkrebszellen streng auf Spezifität validiert. Die Methoden wurden weiter auf Empfindlichkeit validiert, indem PDOs steigenden Strahlendosen ausgesetzt wurden. Dies führte zu einem Anstieg der ɣ-H2AX-, RAD51- und RPA-Schwerpunkte in HRR-kompetenten PDOs. Schließlich erleichtern die objektiven Quantifizierungsmethoden die Reproduzierbarkeit dieses Assays und vermeiden die subjektive Verzerrung der manuellen Quantifizierung.
Traditionelle Methoden zur Erforschung der DDR sind durch 2D-Kultivierungsbedingungen, die als Zelllinien bekannt sind, aber sie haben nicht die Fähigkeit, die genetische Heterogenität des ursprünglichen Tumors aufrechtzuerhalten. Die Tumormikroumgebung ist entscheidend für die Tumorentstehung und Chemotherapieresistenz bei Eierstockkrebs26,27,28, daher bieten diese Modelle einen Vorteil für homogene 2D-Zellkulturen bei der Untersuchung der DDR. Bei der Untersuchung der DDR ist es notwendig, den Zellzyklus zu kontrollieren, um eine Fehlklassifizierung der Unfähigkeit zu vermeiden, bestimmte Arten von DNA-Reparaturen durchzuführen, die zellzyklusspezifisch sind (z. B. HRR). Zukünftige Arbeiten konzentrieren sich auf die Untersuchung spezifischer Arten von DNA-Läsionen, die durch Platin-Chemotherapie, Poly (ADP-Ribose)-Polymerase-Inhibitoren oder Hydroxyharnstoff verursacht werden.
Schließlich ist dieses Protokoll anpassungsfähig, um jedes Antigen zu untersuchen, das für die traditionelle Immunfluoreszenz geeignet ist, und kann die Untersuchung neuartiger Arzneimitteltherapien ermöglichen. Das vorgestellte Protokoll konzentriert sich auf DDR-Proteine, aber mit einem einfachen Wechsel der Antikörper kann dieses Protokoll modifiziert werden, um andere Proteine, Glykane und kleine Moleküle zu untersuchen. Da es sich bei den Organoiden um heterogene 3D-Modelle handelt, die in vitro kultiviert wurden, ist außerdem jede Behandlung der Organoide möglich, einschließlich Immuntherapie, antiangiogener Therapie, Metabolomik-Therapie und anderer neuartiger Therapien, die in homogenen Zelllinien schwer zu bewerten sind 29,30,31.
Zu den Einschränkungen dieser Methode gehört die Verwendung eines BME mit inkonsistenter Zusammensetzung und unspezifischer Färbung. Da kommerzielle BMEs aus Zelllinien hergestellt werden, kann die Zusammensetzung jeder Einheit enorm variieren. Diese Unterschiede könnten sich auf die Fixierung und Färbung sowie auf die Erzeugung von Organoiden auswirken. Darüber hinaus kann es je nach Probe zu einer unspezifischen Färbung des BME kommen, die das interessierende Protein verstopfen kann. Nichtsdestotrotz ist die Kernfärbung sehr spezifisch und zeigt klare Kernherde, die leicht quantifiziert werden können.
Abschließend wird ein detailliertes Protokoll zur Bewertung von DDR-Proteinen in Organoiden vorgestellt. Mit fortschreitender Technologie wird erwartet, dass Organoide in der Lage sein werden, die Reparatur von DNA-Schäden an lebenden Zellen in diesen 3D-Modellen zu bewerten. Darüber hinaus werden die Organoide als effektivste Methode zur Kultivierung etabliert, und anspruchsvollere Assays wie DNA-Faser- und Replikationslücken-Assays werden möglich sein32.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die Anleitung von Pavel Lobachevsky, PhD, bei der Erstellung dieses Protokolls. Wir möchten uns auch bei der School of Medicine der Washington University in St. Louis, der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie und der Abteilung für gynäkologische Onkologie, dem Dean's Scholar Program der Washington University, der Gynäkologischen Onkologie Group Foundation und dem Reproductive Scientist Development Program für ihre Unterstützung dieses Projekts bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M.
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
