عزل الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة والأوعية الدموية الكبيرة وتنقيتها من العينات المشتقة من الرئة
Summary
على الرغم من التحدي ، فإن عزل الخلايا البطانية الرئوية ضروري للدراسات حول التهاب الرئة. يصف هذا البروتوكول إجراء للعزل عالي الغلة وعالي النقاء للخلايا البطانية الوعائية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة.
Abstract
يمثل توافر الخلايا المعزولة من الأنسجة والأعضاء السليمة والمريضة عنصرا أساسيا لنهج الطب الشخصي. على الرغم من أن البنوك الحيوية يمكن أن توفر مجموعة واسعة من الخلايا الأولية والخالدة للبحوث الطبية الحيوية ، إلا أنها لا تغطي جميع الاحتياجات التجريبية ، لا سيما تلك المتعلقة بأمراض أو أنماط وراثية معينة. الخلايا البطانية الوعائية (ECs) هي المكونات الرئيسية للتفاعل الالتهابي المناعي ، وبالتالي ، تلعب دورا مركزيا في التسبب في مجموعة متنوعة من الاضطرابات. والجدير بالذكر أن ECs من مواقع مختلفة تعرض خصائص كيميائية حيوية ووظيفية مختلفة ، مما يجعل توفر أنواع محددة من EC (أي الأوعية الدموية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة والشرايين والوريدية) أمرا ضروريا لتصميم تجارب موثوقة. هنا ، يتم توضيح الإجراءات البسيطة للحصول على خلايا بطانة الأوعية الدموية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة البشرية عالية الغلة والنقية تقريبا من الشريان الرئوي وحمة الرئة بالتفصيل. يمكن إعادة إنتاج هذه المنهجية بسهولة بتكلفة منخفضة نسبيا من قبل أي مختبر لتحقيق الاستقلال عن المصادر التجارية والحصول على الأنماط الظاهرية / الأنماط الجينية EC التي لم تتوفر بعد.
Introduction
تبطن البطانة الوعائية السطح الداخلي للأوعية الدموية. يلعب أدوارا رئيسية في تنظيم تخثر الدم ، ونغمة الأوعية الدموية ، والاستجابات المناعيةالالتهابية 1،2،3،4. على الرغم من أن ثقافة الخلايا البطانية (ECs) المعزولة من العينات البشرية ضرورية لأغراض البحث ، إلا أنه يجب ملاحظة أن ECs من الأوعية الدموية المختلفة (الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية) لها وظائف محددة. لا يمكن تلخيصها بالكامل بواسطة الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC) ، والتي تتوفر بسهولة وتستخدم على نطاق واسع في الدراسات حول الفيزيولوجيا المرضية للبطانة الوعائية 5,6. على سبيل المثال ، تلعب الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للرئة البشرية (HLMVECs) أدوارا رئيسية في التهاب الرئة من خلال التحكم في تجنيد الكريات البيض وتراكمها 4,7. وبالتالي ، يجب أن يشمل الإعداد التجريبي الذي يهدف إلى إعادة إنتاج التهاب الرئة بدقة عالية HLMVECs. من ناحية أخرى ، يمكن ملاحظة خلل EC في العديد من الأمراض. لذلك ، تعتبر ECs من المريض أساسية لبناء نموذج موثوق به في المختبر للمرض. على سبيل المثال ، مكننا عزل شظايا ECs من الشريان الرئوي (HPAECs) ، التي تم تشريحها من الرئتين المزروعتين للأشخاص المصابين بالتليف الكيسي (CF) ، من الكشف عن آليات الخلل البطاني في هذا المرض 8,9.
وبالتالي ، فإن البروتوكولات التي تهدف إلى تحسين عزل ECs من مصادر / أجهزة مختلفة أيضا في حالات المرض ضرورية لتزويد الباحثين بأدوات بحث قيمة ، خاصة عندما لا تكون هذه الأدوات متاحة تجاريا. تم الإبلاغ سابقا عن بروتوكولات عزل HLMVEC و HPAEC 10،11،12،13،14،15،16،17،18،19. في جميع الحالات ، أدى الهضم الأنزيمي لعينات الرئة إلى مجموعات خلايا مختلطة ، والتي تم تنقيتها باستخدام وسائط انتقائية مخصصة وفرز الخلايا القائمة على الخرز المغناطيسي أو الخلايا الخلوية. يجب أن تعالج التحسينات الإضافية لهذه البروتوكولات مسألتين رئيسيتين في عزل EC: (1) تلوث الخلايا والأنسجة ، والتي يجب حلها في أقرب ممرات استزراع ممكنة لتقليل الشيخوخة المتماثلة EC20 ؛ و (2) العائد المنخفض لعزلات EC الأولية.
تصف هذه الدراسة بروتوكولا جديدا للعزل عالي الغلة وعالي النقاء ل HLMVECs و HPAECs. يمكن تطبيق هذا الإجراء بسهولة وإعطاء ECs الأوعية الدموية الكبيرة والأوعية الدموية الدقيقة النقية تقريبا في بضع خطوات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأدوار المتعددة التي تلعبها الخلايا البطانية الوعائية في الفيزيولوجيا المرضية البشرية تجعل هذه الخلايا أداة لا غنى عنها للدراسات المرضية والدوائية في المختبر . نظرا لأن ECs من مواقع / أعضاء الأوعية الدموية المختلفة تعرض ميزات ووظائف غريبة ، فإن توفر ECs صحية ومريضة من الجهاز محل الاهت…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بأموال من وزارة الجامعة والبحوث الإيطالية (60٪ سابقا 2021 و 2022) إلى R. P. وبمنح من مؤسسة التليف الكيسي الإيطالية (FFC # 23/2014) ومن وزارة الصحة الإيطالية (L548/93) إلى M. R.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
Referências
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
