Выделение и очистка микрососудистых и макрососудистых эндотелиальных клеток из образцов, полученных из легких
Summary
Несмотря на сложную задачу, выделение эндотелиальных клеток легких имеет важное значение для исследований воспаления легких. В настоящем протоколе описана процедура выделения макрососудистых и микрососудистых эндотелиальных клеток с высоким выходом и высокой чистотой.
Abstract
Наличие клеток, выделенных из здоровых и больных тканей и органов, представляет собой ключевой элемент для подходов персонализированной медицины. Хотя биобанки могут предоставить широкую коллекцию первичных и иммортализированных клеток для биомедицинских исследований, они не покрывают все экспериментальные потребности, особенно те, которые связаны с конкретными заболеваниями или генотипами. Эндотелиальные клетки сосудов (ЭК) являются ключевыми компонентами иммунной воспалительной реакции и, таким образом, играют центральную роль в патогенезе различных заболеваний. Примечательно, что ЭК из разных сайтов демонстрируют разные биохимические и функциональные свойства, что делает наличие определенных типов ЭК (т. е. макрососудистых, микрососудистых, артериальных и венозных) необходимым для разработки надежных экспериментов. Здесь подробно проиллюстрированы простые процедуры получения высокопродуктивных, практически чистых макрососудистых и микрососудистых эндотелиальных клеток человека из легочной артерии и паренхимы легких. Эта методология может быть легко воспроизведена с относительно низкими затратами любой лабораторией для достижения независимости от коммерческих источников и получения фенотипов/генотипов ЕС, которые еще недоступны.
Introduction
Эндотелий сосудов выстилает внутреннюю поверхность кровеносных сосудов. Он играет ключевую роль в регуляции свертываемости крови, сосудистого тонуса и иммунно-воспалительных реакций 1,2,3,4. Хотя культура эндотелиальных клеток (ЭК), выделенных из образцов человека, имеет важное значение для исследовательских целей, следует отметить, что ЭК из разных кровеносных сосудов (артерий, вен, капилляров) выполняют определенные функции. Они не могут быть полностью воспроизведены эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC), которые легко доступны и широко используются в исследованиях патофизиологии эндотелия сосудов 5,6. Например, микрососудистые эндотелиальные клетки легких человека (HLMVEC) играют ключевую роль в воспалении легких, контролируя рекрутирование и накопление лейкоцитов 4,7. Таким образом, экспериментальная установка, направленная на воспроизведение воспаления легких с высокой точностью, должна включать HLMVEC. С другой стороны, дисфункция ЭК может наблюдаться при нескольких патологиях; таким образом, ЭК от пациента имеют основополагающее значение для построения надежной модели заболевания in vitro. Например, выделение фрагментов ЭК из легочной артерии (ГПАЭК), рассеченных из эксплантированных легких людей, страдающих муковисцидозом (МВ), позволило выявить механизмы эндотелиальной дисфункции при этом заболевании 8,9.
Таким образом, протоколы, направленные на оптимизацию выделения ЭК из различных источников/органов, в том числе в болезненных состояниях, необходимы для предоставления исследователям ценных исследовательских инструментов, особенно когда эти инструменты не являются коммерчески доступными. Ранее сообщалось о протоколах изоляции HLMVEC и HPAEC 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Во всех случаях ферментативное переваривание образцов легких приводило к смешанным клеточным популяциям, которые очищали с использованием специальных селективных сред и сортировки клеток на основе магнитных шариков или цитометрических данных. Дальнейшая оптимизация этих протоколов должна быть направлена на решение двух основных проблем при выделении ЕС: (1) загрязнение клеток и тканей, которое должно быть решено при как можно более раннем прохождении культивирования, чтобы свести к минимуму репликативное старение ЭК20; и (2) низкий выход первичных изолятов ЕС.
В этом исследовании описывается новый протокол для выделения высокопроизводительных и высокочистых HLMVEC и HPAEC. Эта процедура может быть легко применима и дает практически чистые макрососудистые и микрососудистые ЭК за несколько шагов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Многочисленные роли, которые играют сосудистые эндотелиальные клетки в патофизиологии человека, делают эти клетки незаменимым инструментом для патогенетических и фармакологических исследований in vitro . Поскольку ЭК из разных сосудистых участков/органов проявляют специфические ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана средствами Министерства университетов и исследований Италии (за исключением 60% 2021 и 2022 гг.) для R. P. и грантами Итальянского фонда муковисцидоза (FFC # 23/2014) и Министерства здравоохранения Италии (L548/93) для M. R.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
Referências
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
