Isolamento e purificazione delle cellule endoteliali microvascolari e macrovascolari da campioni derivati dai polmoni
Summary
Sebbene impegnativo, l’isolamento delle cellule endoteliali polmonari è essenziale per gli studi sull’infiammazione polmonare. Il presente protocollo descrive una procedura per l’isolamento ad alto rendimento e ad alta purezza delle cellule endoteliali macrovascolari e microvascolari.
Abstract
La disponibilità di cellule isolate da tessuti e organi sani e malati rappresenta un elemento chiave per approcci di medicina personalizzata. Sebbene le biobanche possano fornire un’ampia collezione di cellule primarie e immortalizzate per la ricerca biomedica, queste non coprono tutte le esigenze sperimentali, in particolare quelle relative a malattie o genotipi specifici. Le cellule endoteliali vascolari (ECs) sono componenti chiave della reazione infiammatoria immunitaria e, quindi, svolgono un ruolo centrale nella patogenesi di una varietà di disturbi. In particolare, le EC di diversi siti mostrano diverse proprietà biochimiche e funzionali, rendendo la disponibilità di specifici tipi di EC (cioè macrovascolari, microvascolari, arteriosi e venosi) essenziale per la progettazione di esperimenti affidabili. Qui, vengono illustrate in dettaglio semplici procedure per ottenere cellule endoteliali macrovascolari e microvascolari umane ad alto rendimento, praticamente pure, dall’arteria polmonare e dal parenchima polmonare. Questa metodologia può essere facilmente riprodotta ad un costo relativamente basso da qualsiasi laboratorio per ottenere l’indipendenza dalle fonti commerciali e ottenere fenotipi/genotipi EC che non sono ancora disponibili.
Introduction
L’endotelio vascolare riveste la superficie interna dei vasi sanguigni. Svolge un ruolo chiave nella regolazione della coagulazione del sangue, del tono vascolare e delle risposte immuno-infiammatorie 1,2,3,4. Sebbene la coltura di cellule endoteliali (CE) isolate da campioni umani sia essenziale per scopi di ricerca, va osservato che le EC provenienti da diversi vasi sanguigni (arterie, vene, capillari) hanno funzioni specifiche. Questi non possono essere completamente ricapitolati dalle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), che sono facilmente disponibili e ampiamente utilizzate negli studi sulla fisiopatologia dell’endotelio vascolare 5,6. Ad esempio, le cellule endoteliali microvascolari polmonari umane (HLMVECs) svolgono un ruolo chiave nell’infiammazione polmonare controllando il reclutamento e l’accumulo di leucociti 4,7. Pertanto, un setting sperimentale volto a riprodurre l’infiammazione polmonare con alta fedeltà dovrebbe includere HLMVECs. D’altra parte, la disfunzione EC può essere osservata in diverse patologie; pertanto, le EC del paziente sono fondamentali per costruire un modello in vitro affidabile della malattia. Ad esempio, l’isolamento di frammenti di EC dall’arteria polmonare (HPAEC), sezionati dai polmoni espiantati di persone affette da fibrosi cistica (FC), ci ha permesso di scoprire meccanismi di disfunzione endoteliale in questa malattia 8,9.
Pertanto, i protocolli volti a ottimizzare l’isolamento delle EC da diverse fonti / organi anche negli stati di malattia sono essenziali per fornire agli investigatori preziosi strumenti di ricerca, in particolare quando questi strumenti non sono disponibili in commercio. I protocolli di isolamento HLMVEC e HPAEC sono stati precedentemente riportati 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. In tutti i casi, la digestione enzimatica dei campioni polmonari ha portato a popolazioni cellulari miste, che sono state purificate utilizzando mezzi selettivi ad hoc e sfere magnetiche o selezione cellulare basata su citometria. Ulteriori ottimizzazioni di questi protocolli devono affrontare due problemi principali nell’isolamento della CE: (1) contaminazione cellulare e tissutale, che dovrebbe essere risolta al più presto possibile per ridurre al minimo la senescenza replicativa EC20; e (2) la bassa resa degli isolati EC primari.
Questo studio descrive un nuovo protocollo per l’isolamento ad alto rendimento e purezza di HLMVEC e HPAEC. Questa procedura può essere facilmente applicabile e fornire EC macrovascolari e microvascolari praticamente pure in pochi passaggi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I molteplici ruoli svolti dalle cellule endoteliali vascolari nella fisiopatologia umana rendono queste cellule uno strumento indispensabile per studi patogenetici e farmacologici in vitro . Poiché le EC provenienti da diversi siti/organi vascolari mostrano caratteristiche e funzioni peculiari, la disponibilità di EC sane e malate dall’organo di interesse sarebbe ideale per scopi di ricerca. Ad esempio, gli HLMVEC sono essenziali per gli studi sull’infiammazione polmonare; Pertanto, una metodologia per l’isola…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da fondi del Ministero dell’Università e della Ricerca (ex 60% 2021 e 2022) a R. P. e da sovvenzioni della Fondazione Italiana Fibrosi Cistica (FFC#23/2014) e del Ministero della Salute italiano (L548/93) a M. R.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
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