أورام الجهاز العصبي المركزي (CNS) هي السبب الرئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان لدى الأطفال ، ويتم اختبار العلاجات القائمة على المناعة المحلية بشكل متزايد للمرضى في التجارب السريرية. يصف هذا البروتوكول طرق زرع القنية الموضعية في الفئران للتقييم قبل السريري للدفعات المناعية التي تستهدف أورام الجهاز العصبي المركزي.
أورام الجهاز العصبي المركزي لدى الأطفال مسؤولة عن غالبية الوفيات المرتبطة بالسرطان لدى الأطفال ولديها توقعات سيئة ، على الرغم من التقدم في العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي. نظرا لأن العديد من الأورام تفتقر إلى العلاجات الفعالة ، فهناك حاجة ماسة لتطوير خيارات علاجية واعدة أكثر ، مثل العلاجات المناعية. استخدام العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) الموجه ضد أورام الجهاز العصبي المركزي له أهمية خاصة. يتم التعبير عن أهداف سطح الخلية مثل B7-H3 و IL13RA2 و disialoganglioside GD2 بشكل كبير على سطح العديد من أورام الجهاز العصبي المركزي للأطفال والبالغين ، مما يزيد من فرصة استخدام العلاج بالخلايا التائية CAR T ضد هذه الأهداف السطحية وغيرها. لتقييم التسليم الموضعي المتكرر للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية في نماذج الفئران قبل السريرية ، تم إنشاء نظام قسطرة ساكن يلخص القسطرة الساكنة المستخدمة حاليا في التجارب السريرية البشرية. على عكس الولادة التجسيمية ، يسمح نظام القسطرة الساكنة بالجرعات المتكررة دون استخدام عمليات جراحية متعددة. يصف هذا البروتوكول الموضع داخل الورم لقنية توجيه ثابتة تم استخدامها لاختبار ضخ الخلايا التائية CAR T التسلسلي بنجاح في نماذج الفئران التقويمية لأورام الدماغ لدى الأطفال. بعد حقن تقويم العظام وتطعيم الخلايا السرطانية في الفئران ، يتم الانتهاء من وضع قنية إرشادية ثابتة داخل الورم على جهاز تجسيمي وتثبيتها بمسامير وراتنج أكريليك. ثم يتم إدخال قنيات العلاج من خلال قنية التوجيه الثابتة لتوصيل الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية المتكررة. يمكن تعديل الوضع التجسيمي للقنية الموجهة لتوصيل الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية مباشرة إلى البطين الجانبي أو مواقع أخرى في الدماغ. توفر هذه المنصة آلية موثوقة للاختبار قبل السريري للحقن المتكرر داخل الجمجمة للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية وغيرها من العلاجات الجديدة لهذه الأورام المدمرة لدى الأطفال.
على الرغم من التحسينات في العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي والجراحة ، فإن أورام الجهاز العصبي المركزي (CNS) هي أكثر الأورام الخبيثة فتكا في طب الأطفال1 ، مما يؤكد الحاجة المهمة لأساليب جديدة ذات نتائج أكثر نجاحا. مع التقدم الكبير في مجال العلاج المناعي ، أظهرت مناهج العلاج الخلوي بالتبني (ACT) نتائج واعدة في العديد من أنواع السرطان ، وخاصة الأورام الخبيثة الدموية2. يستفيد العلاج بالخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) ، وهو نوع معين من ACT ، من القدرة الطبيعية للجهاز المناعي على التعرف على الخلايا الضارة وقتلها عن طريق إعادة توجيه خصوصية الخلايا التائية لتوليد الخلايا التائية التي تستهدف الورم3. أظهر العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية نجاحا كبيرا في علاج اللوكيميا والأورام اللمفاوية4 ، مما يجعله نهجا علاجيا مناعيا واعدا ويشجع على التحقيق في الأورام الصلبة. ومع ذلك ، حتى الآن ، حقق العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية في الأورام الصلبة نجاحا سريريا ضئيلا ويواجه العديد من التحديات ، مثل اختراق الورم غير الفعال ، والمستضدات المحدودة القابلة للاستهداف ، والبيئة المكروية القمعيةللورم 5.
بدأت التجارب السريرية الأخيرة في تقييم العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية لأورام الجهاز العصبي المركزي لدى الأطفال ، مما يوفر دليلا على المفهوم والأدلة المبكرة على نشاط الخلايا التائية في التقارير الأولية6،7،8. بينما ركزت معظم البيانات الأولية قبل السريرية على التوصيل الوريدي للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية ، فقد أشارت الأدلة قبل السريرية الحديثة إلى تفوق التسليم الموضعي في الجهاز العصبي المركزي9،10 ، والذي تم استخدامه أيضا بنجاح في العديد من التجارب السريرية6،7،8،11. اعتمدت الدراسات قبل السريرية حتى الآن التي أدرجت التسليم الموضعي للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية في الجهاز العصبي المركزي على جرعة واحدة داخل الجمجمة من الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية التي يتم تسليمها بشكل تجسيمي 9,10. ومع ذلك ، فقد تطلبت التجارب السريرية على البشر دفعات متكررة من الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية في الجهاز العصبي المركزي6،7،8،11 ، مما يؤكد الحاجة إلى تقييم الحقن المتكررة المتعددة في التطور قبل السريري. الهدف من هذا الإجراء هو اختبار ضخ الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية بنجاح باستخدام قسطرة في نماذج الفئران التقويمية لأورام الدماغ لدى الأطفال. ميزة هذه التقنية هي تجنب العمليات الجراحية المتعددة لتوفير علاجات متكررة داخل الجهاز العصبي المركزي. تم استخدام الكانيولا في المقام الأول لأخذ عينات غسيل الكلى الدقيقة من الناقلات العصبية وتوصيل المواد العصبية في علم الأعصاب والبحوث السلوكية في القوارض12 ، مع تقارير محدودة عن استخدامها لتقديم العلاجات المضادة للسرطان. بناء على التقارير السابقة ، يستخدم هذا البروتوكول نظام قنية ساكنة موضوعة بشكل تجسيمي لتوصيل خلايا CAR T في نماذج الفئران ذات الطعم الأجنبي لأورام الجهاز العصبي المركزي. يمكن استخدام البروتوكول لاختبار علاجات إضافية في نماذج الفئران للاضطرابات العصبية أو العصبية للأورام ، وقد يكون مفيدا لاختبار علاجات جديدة حيث يكون تجاوز الحاجز الدموي الدماغي أمرا بالغ الأهمية للفعالية.
أحدث العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية ثورة في علاج سرطانات الدم ويظهر قيمة واعدة في علاج أورام المخ الصلبة6،7،8. تم تصميم هذا البروتوكول لتمكين التقييم قبل السريري لتوصيل الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية المحلية لعلاج أورام الجهاز العصبي المركزي لدى الأطفال. يكرر نظام القنية خزان Ommaya أو Rickham ، وهو نظام قسطرة داخل البطيني يستخدم حاليا في التجارب السريرية الجارية للعلاج بالخلايا التائية CAR T في أورام الجهاز العصبي المركزي للأطفال6،7،8 ، مما يؤكد أهمية هذه الأساليب وإمكاناتها الانتقالية. يسمح هذا النظام بالتسليم المتكرر للخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية التي تتجاوز الحاجز الدموي الدماغي ، مرة أخرى على غرار الأساليب المستخدمة في التجارب السريرية الجارية. ويمكن أن يوفر التسليم الموضعي أقصى قدر من الفعالية في الجهاز العصبيالمركزي 9 وقد يقلل أيضا من خطر السمية الجهازية المرتبطة بالاتجار من الدورة15. في حين أن التسليم التجسيمي يمكن أن يوفر جرعة واحدة في الجهاز العصبي المركزي ، فإن ميزة هذا النظام هي فرصة توفير جرعات متكررة متعددة في مكان محدد في الجهاز العصبي المركزي دون الحاجة إلى عمليات جراحية متعددة. وتشمل قيود هذا الإجراء وجود موقع تسليم ثابت دون القدرة على تغيير الموقع أو إجراء تعديلات بمجرد وضع القنية في مكانها، وإمكانية إزاحة القنية.
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في زرع قنية التوجيه الثابتة عند إحداثيات D / V التي تأخذ في الاعتبار إسقاط قنيات العلاج. ستبرز قنية العلاج خارج طرف قنية التوجيه ، لذا يجب توخي الحذر لضمان أن يؤدي التنسيب إلى توصيل الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية إلى المنطقة المعنية. يمكن تخصيص أطوال إسقاط قنية العلاج ، وفي تجربة المؤلف ، 0.5 مم هو طول إسقاط مفيد. يضمن هذا الطول عدم بقاء العلاج في قنية التوجيه عند الاستغناء ، ولكنه لا يتطلب أيضا تعديلا كبيرا لإحداثيات D / V لقنية التوجيه إلى المنطقة المعنية. خطوة إضافية مهمة في هذا البروتوكول هي الوقت الذي تترك فيه قنية العلاج في مكانها بعد ضخ الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية الخيمرية (CAR T). يجب تثبيت قنية العلاج في مكانها لمدة 1 دقيقة على الأقل بعد نهاية التسريب ، لمنع التسربات وفقدان التوصيل الموضعي للعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية .
استكشاف أخطاء هذه الطريقة واضحة ومباشرة ، حيث تتضمن معظم المضاعفات صعوبة في إزالة القنية الوهمية أو إدخال قنية العلاج في قنية التوجيه الثابتة ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى جفاف الدم داخل القنية التوجيهية. يمكن حل ذلك بسهولة عن طريق تمرير القنية الوهمية برفق عبر قنية التوجيه حتى تقل المقاومة ويتم إزالة الحطام. يمكن أن يزيح راتنج الأكريليك أحيانا من الجمجمة ، مما يؤدي إلى فقدان نظام القنية. في تجربتنا ، يكون هذا محدودا بشكل عام عن طريق تسجيل الجمجمة بمشرط ووضع مسمارين. بالإضافة إلى ذلك ، تتم إزالة أي عناصر من القفص قد تطبق القوة عن طريق الخطأ على القنية أثناء تحرك الماوس ، مثل أكواخ تخصيب الماوس الخاصة ذات الفتحات الصغيرة.
في الختام ، الموصوف هنا هو بروتوكول لإدخال نظام قنية في نماذج الفئران من أورام الجهاز العصبي المركزي للتسليم المتكرر للخلايا التائية CAR. يمكن تعديل وضع القنية إلى مواقع تسليم محلية متعددة ، واختبار فعالية مواقع التسليم المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا النظام لعلاجات إضافية تتجاوز الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية لتقييم الفعالية عند تجاوز الحاجز الدموي الدماغي ، وقد يكون مفيدا أيضا لتقييم العلاجات في نماذج الفئران للاضطرابات غير الأورام.
The authors have nothing to disclose.
تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل مؤسسة ماثيو لارسون ، ومؤسسة غرايسون ينقذ ، وجائزة هيونداي هوب أون ويلز للمحقق الشاب ، ومؤسسة كورتني روز ، والمعاهد الوطنية للصحة NCI K12 CA076931-19 و 1K08CA263179-01 ، ووزارة الدفاع W81XWH-21-1-0221.
18 G needles | BD | 511097 | 1 1/2 inch metal hub |
Acrylic resin liquid | Lang Dental | B1323 | |
Acrylic resin powder | Lang Dental | B1323 | |
Alcohol wipes | BD | 326895 | |
Centrifuge 5240 | Eppendorf | 5420000040 | Centrifuge |
Cotton tipped swabs | Puritan | 826-WC | Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500) |
Drill bit holder | P1 Technologies | DH-1 | Drill bit holder for D56-D70 |
Drill bit | P1 Technologies | D58 | 1.07 mm |
Dummy cannula | P1 Technologies | C315DCS-5/SPC | Configuration: Small cap; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
Flat tip screwdriver | P1 Technologies | SD-80 | Screwdriver |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Forceps |
Guide cannula | P1 Technologies | C315GS-5/SPC | Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal |
Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine | Pascal | 1151602 | |
MOXI Z Mini automated cell counter Kit | Moxi | MXZ001 | Cell counter |
NOD scid gamma (NSG) mice | Jackson Laboratory | 5557 | 6 to 12-week-old males and females |
Pasteur pipet | VWR | 14673-043 | |
PKG tubing | P1 Technologies | C313CT | Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm |
Porcelain 12 well plate | Flinn Scientific | AP6064 | |
Povidone iodine | Medline | MDS093943 | |
Scalpel | World Precision Instrument | 50-822-457 | Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6" Ruler |
Screws | P1 Technologies | 0-80 X 3/32 | 2.4 mm |
Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 940 | Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console |
Student fine scissors | Fine Science Tools | 91460-12 | Scissors |
Treatment cannula | P1 Technologies | C315IS-5/SPC | 33GA; Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
Treatment syringes | Hamilton | 87908 | 5 µL, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5"/PT3 |
Vactrap XL | Foxx Life Sciences | 305-4401-FLS | Vacuum System |