여기에서 우리는 이질적인 세포주, 특히 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)를 특성화하기 위한 무표지 접근 방식으로 광 유도 이전기영동을 제시합니다. 이 논문은 hMSC의 본래 상태를 변경하지 않고 전기적 거동을 특성화하기 위해 광도전층이 있는 미세유체 장치를 사용하고 최적화하기 위한 프로토콜을 설명합니다.
인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)는 질병에 대한 기계론적 연구를 수행하거나 여러 치료 응용 분야를 위한 환자 유래 세포 공급원을 제공합니다. 다양한 성숙 단계에서의 전기적 거동과 같은 hMSC 특성을 이해하는 것이 최근 몇 년 동안 더욱 중요해졌습니다. 이전기영동(DEP)은 불균일한 전기장에서 세포를 조작할 수 있는 방법으로, 이를 통해 세포막 정전용량 및 유전율과 같은 세포의 전기적 특성에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. DEP의 기존 모드는 DEP에 대한 셀의 반응을 특성화하기 위해 3차원 전극과 같은 금속 전극을 사용합니다. 이 논문에서 우리는 쉽게 순응할 수 있는 기하학적 구조를 가진 현장 가상 전극 역할을 하는 광 투영을 통해 세포를 조작할 수 있는 광전도층으로 구축된 미세 유체 장치를 제시합니다. hMSC를 특성화하기 위해 LiDEP(Light-induced DEP)라고 하는 이 현상을 입증하는 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 우리는 세포 속도로 측정되는 LiDEP 유도 세포 반응이 입력 전압, 광 투영의 파장 범위 및 광원의 강도와 같은 다양한 매개변수에 의해 최적화될 수 있음을 보여줍니다. 앞으로 우리는 이 플랫폼이 라벨이 없고 hMSC 또는 기타 줄기 세포주의 이질적인 집단의 실시간 특성화를 수행하는 기술을 위한 길을 열 수 있을 것으로 예상합니다.
인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)는 면역억제 특성1으로 인정받고 있으며, 이로 인해 제2형당뇨병2, 이식편대숙주질환3, 간 질환4과 같은다양한 질환을 치료하기 위한 치료제로 사용되고 있다. HMSC는 이질적이며 지방 세포, 연골 세포 및 조골 세포로 분화하는 세포의 하위 집단을 포함합니다. HMSC는 지방조직, 탯줄 조직 및 골수에서 유래하며, 이들의 분화 가능성은 기원 조직과 사용된 세포 배양 공정에 따라 다르다5. 예를 들어, Sakaguchi et al.의 연구에 따르면, 지방 조직에서 유래한 hMSC는 지방 세포로 분화할 가능성이 더 높은 반면, 골수에서 유래한 hMSC는 골세포로 분화할 가능성이 더 높다고 한다 6. 그러나 hMSC의 조직 기원이 분화 가능성에 미치는 영향은 여전히 더 이해해야 하는 현상입니다. 또한, hMSC의 다양한 차별화 잠재력은 고유한 이질성에 기여하고 hMSC를 치료제에 적용하는 데 어려움을 야기합니다. 따라서 이종 줄기 세포주의 특성화 및 분류는 이러한 세포의 시험관 내 및 임상 적용을 개발하는 데 중요합니다. 세포 표현형의 차이를 검사하기 위한 황금 표준 기술인 유세포 분석은 세포 표면 항원과 형광 염료를 사용하여 표적 세포를 표지하고 광 산란 또는 세포 특이적 형광 특성을 기반으로 특성화합니다 6,7,8. 이 방법의 단점은 세포 표면 항원 바이오마커의 제한된 가용성, 높은 장비 및 운영 비용, 세포 표면 염색이 잠재적으로 세포막을 손상시키고 치료 적용에 영향을 미칠 수 있다는 사실을 포함합니다 9,10,11. 따라서 세포막의 본래 상태를 손상시키지 않으면서 세포 특성화를 위한 새로운 기술을 탐색하면 줄기 세포 치료제의 임상 성능에 도움이 될 수 있습니다.
표면 라벨을 사용하지 않는 세포 특성화 방법인 디전기영동(DEP)이 현재 작업의 초점입니다. DEP는 전기적 특성에 따라 이질적인 세포 집단을 특성화하기 위해 미세유체 플랫폼에 구현된 무표지 또는 비염색 방법입니다. DEP는 형광 염색(즉, 라벨 기반 방법)을 대체하기 위해 교류(AC) 전기장을 사용합니다7. 세포 특성화를 위해 DEP 기반 미세유체 장치를 사용할 때의 다른 이점으로는 소량(마이크로리터)의 사용, 빠른 분석 시간, 최소 세포 샘플 준비 요구 사항, 최소 샘플 오염 위험, 최소 폐기물 생산 및 저렴한 비용이 있습니다12,13. DEP의 또 다른 이점은 셀(14, 15, 16)의 실시간 모니터링이다. DEP의 경우, 현탁액의 세포는 전극으로 생성된 불균일한 AC 전기장에 노출되어 분극화된다6. 이 분극은 세포 이동을 유발하고 인가된 AC 전기장의 주파수와 전압에 따라 세포 조작을 허용합니다. 일반적으로 5 kHz 내지 20 MHz 사이의 주파수를 조절함으로써, 전지는 전극에 끌리거나 전극으로부터 멀어지게 될 수 있으며, 이는 각각 포지티브 및 네거티브 DEP 거동에 해당한다6.
DEP 특성화에는 전극 구성 및/또는 작동 전략(17)에 의해 분류되는 전통적, 필드 유동 분별(field flow fractionation) 및 광유도(light-induced )의 여러 모드가 있다. 기존 DEP 모드인 3DEP 분석기는 물리적 금속 전극을 통합하고 AC 전기장에 대한 셀룰러 반응을 모니터링합니다. 이 시스템은 다중 3차원 원형 전극을 갖는 마이크로웰로 구성된 칩을 사용하며, 셀 DEP 거동을 특성화하기 위해 광도의 변화를 검출한다(18,19,20,21). 양성 DEP는 세포가 마이크로웰의 벽을 따라 원형 전극의 가장자리를 향해 이동함에 따라 관찰되며, 그 결과 마이크로웰의 중심에서 광도가 증가합니다. 음의 DEP는 원형 전극으로부터 멀리 떨어진 마이크로웰의 중심에 군집하는 세포로 관찰되며, 그 결과 마이크로웰의 중심에서 광도가 감소합니다. 이 두 가지 현상은 그림 1에 나와 있습니다. 전통적인 DEP 방법은 이질적인 세포 집단 18,20,21의 전기적 특성을 특성화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 예를 들어, Mulhall et al. 3DEP 분석기를 사용하여 막 정전 용량21의 차이를 기반으로 정상 구강 각질 세포(HOK)와 악성 구강 각질 세포(H357) 세포주를 구별할 수 있는 가능성을 입증했습니다. 그러나 기존 DEP 모드의 한 가지 한계는 고정 전극 형상입니다. hMSC는 이질적이기 때문에 DEP 평가 중에 전극 형상을 쉽게 수정할 수 있는 능력이 있는 것이 유리합니다. 예를 들어, 단일 셀 트래핑을 위해 전극 또는 전극 어레이를 실시간으로 수정할 수 있으므로 속도 및 DEP 동작에 따라 셀을 특성화할 수 있습니다. hMSC의 DEP 평가에 실시간 전극 변형을 적용하면 샘플 조직에서 hMSC를 소싱한 직후 hMSC의 단일 세포 분석을 통해 샘플 집단의 이질성을 특성화할 수 있습니다.
기존 DEP 모드(즉, 고정된 물리적 전극)의 한계를 극복하고 DEP 현상을 사용하여 실시간 전극 구성 수정을 위한 새로운 기회를 모색하기 위해 광 유도 DEP(LiDEP)가 탐색되었습니다. LiDEP는 광 투영을 통해 광전도성 미세유체 소자(22,23)를 사용하여 세포를 조작하는 DEP의 비전통적인 모드이며, 국부적 전극은 전통적인 DEP 방법과 유사하게 불균일한 전기장을 생성합니다. 이 접근법은 또한 전극 기하학의 유연성 및 미세유체 장치 내에서 전극을 이동시키는 것을 허용한다. 이는 고정 전극에서 볼 수 있는 한계를 완화하고 세포 이질성에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있는 기회를 제공합니다. LiDEP는 균질 및 이질적인 세포 집단에서 다양한 세포 유형을 검출하고 분석하는 데 사용되었습니다22,23,24. 예를 들어, Liao et al. LiDEP를 사용하여 적혈구에서 상피 세포 접착 모듈(EpCAMneg)을 발현하는 순환 종양 세포(CTC)를 분리하여 암 전이에서 이들의 중요성을 탐색했습니다22. LiDEP를 이용한 단세포 분석은 췌장 종양 형성성의 층화와 전이 전후 샘플의 CTC 분석을 통해 암세포를 특성화하고 조작하는 데 성공적으로 사용되었습니다24.
여기에서는 다양한 전극 형상(원, 다이아몬드, 별 및 평행선) 및 시스템 설정(인가 전압, 광도 및 미세 유체 장치 재료)으로 hMSC를 조작하는 데 LiDEP를 활용하여 가상 전극을 사용하여 인간 유래 줄기 세포의 거동을 특성화하는 접근 방식을 제공합니다.
hMSC의 이질성을 조사하는 것은 치료제의 발전에 중요합니다. 이 작업은 hMSC 평가를 위한 분석 도구로 LiDEP를 사용하기 위한 첫 번째 단계를 제공합니다. 우리는 속도를 정량화하여 LiDEP에서 세포의 양의 DEP 응답의 전압 의존성을 조사했습니다. 더 높은 전압은 더 강한 양의 DEP 힘을 생성해야 할 것으로 예상되며, 측정된 속도로 이 패턴을 관찰했습니다. 10 V pp 및 20 Vpp 전압은 LiDEP를 사용하여 hMSC를 조작하기에 충분했습니다. 더 낮은 전압(즉, 5Vpp)은 셀 응답이 느려졌습니다. hMSC에는 최적이 아니지만 다른 세포 유형에는 유리할 수 있습니다. hMSCs의 생존력에서 전압에 따라 약 9%의 감소가 있었다. 이는 종래의 문헌 6,12,28,29와 약간 상이한데, 여기서 생물학적 세포의 검사에서 전통적인 DEP 및 LiDEP의 사용은 세포 생존율을 감소시키지 않았다. 그러나 각 연구의 실험 목적은 다양했다. Glasser와 Fuhr는 세포 배양 배지28에서 금속 전극 상에서 부착성 L929 마우스 섬유아세포의 성장을 모니터링하였다. 반대로, Lu et al. 서로 다른 기간 동안 AC 전기장에 노출된 신경 줄기 세포의 생존 가능성을 조사했습니다12. Adams et al. 금속 전극12를 갖는 hMSCs의 유전 특성을 특성화하고, Li et al. LiDEP29로 백혈병 세포를 조작하였다. 이 연구와 우리의 연구의 차이점은 BSA의 사용이었는데, 이는 우리가 관찰한 생존력 감소의 원인일 수 있습니다. 그러나, 더 낮은 전체 생존율은 또한 여기에 확립된 프로토콜에 사용된 노출 시간(2분 30초) 때문일 수 있다. 이 시간은 불균일한 AC 전기장에 노출되는 동안 세포 조작을 시각화하기에 충분한 시간을 제공하기 위해 선택되었습니다.
셀 특성화 방법은 프로토콜에 설명된 대로 구축된 LiDEP 시스템의 기능과 한계를 결정하기 위해 전극 색상을 통해 테스트되었습니다. 이 특정 프로토콜에서, 전극 색상은 그래픽 편집기 파일을 통해 투사되는 형상의 색상에 기초하여 제어될 수 있다. 흰색, 노란색, 빨간색, 파란색의 네 가지 색상을 사용했습니다. 각 색상에 대한 전력 출력 판독 값으로부터, 투영 된 황색 (#FFFF00) 및 백색 (#FFFFFF) 전극이 더 높은 강도를 갖는 것으로 측정되었으며, 이는 이들 색상이 후속 실험에서 사용하기에 더 유리한 이유의 기초였다. 또한, 광전도성 재료30,31의 확립된 광도 의존성으로 인해, 결과는 LiDEP 장치의 성능이 광전도성 A:Si에 의존하고 투영된 전극 색상의 선택에 의해 조정될 수 있음을 시사한다. hMSC의 양성 및 음성 DEP 반응의 조합도 LiDEP를 사용하여 관찰되었으며, 이는 기존 DEP 방법에서 볼 수 있는 현상과 유사합니다. 각 전극 색상에 따라 hMSC는 음의 DEP 힘, 양의 DEP 힘 및 세포 회전을 경험했으며, 이는 세포 샘플이 단일 주파수에서 이질적임을 나타냅니다(보충 비디오 1). 이는 hMSC가 단일 주파수에서 음성 및 양성 DEP 거동을 모두 나타낸다는 Adams et al.6의 발견과 일치합니다. 이러한 조건(전극 색상, 전극 형상 및 광전도성 물질)은 hMSC 샘플에서 이질성의 레벨을 검출하기 위한 추가의 파라미터를 제공할 수 있다.
마지막으로, LiDEP 평가 결과를 hMSC DEP 동작의 벤치마크로 3DEP 분석기의 결과와 비교했습니다. hMSC의 양성 DEP 반응의 주파수 범위의 차이가 관찰되었지만 LiDEP와 3DEP 분석기를 통해 수집된 데이터의 경향은 전반적으로 유사했습니다(즉, 양성 DEP 응답은 빈도가 증가함에 따라 감소함). LiDEP 칩에 AC 전기장이 공급되고 빛이 투사되면 광 투영 내 영역의 컨덕턴스가 떨어져 불균일한 전기장이 생성됩니다. 따라서 광원의 특성(즉, 강도 및 파장)은 전압 및 전극 색상 변화 테스트 결과에서 볼 수 있듯이 LiDEP 칩 내 셀의 예상 응답에 영향을 미칩니다. 수정할 수 있는 다른 매개변수는 광도전층의 재료와 DEP 버퍼 용액의 전도도입니다. 따라서 셀의 DEP 동작을 평가하는 데 사용되는 조건은 LiDEP 시스템의 설정을 기반으로 평가되어야 합니다. 반대로, 3DEP 분석기 또는 금속 전극을 사용하여 DEP 힘을 적용하는 다른 방법의 경우 전극 특성이 일정하며 조사 중인 셀에 필요한 것에 적응하기 위해 즉시 변경할 수 없습니다. 양성 DEP 거동의 이러한 변화는 hMSC 샘플 내 다양한 세포 유형의 특성화, 단일 세포 분석 또는 세포 분류에 대한 향후 연구에 도움이 될 수 있습니다. 또한 셀이 가상 전극에서 멀어질수록 AC 전기장이 약해집니다. 그러나 3DEP 분석기 또는 금속 전극을 사용하는 다른 기존 DEP 모드를 사용하면 더 큰 전기장 영역을 적용할 수 있으므로 더 많은 셀을 조작할 수 있습니다. 따라서 LiDEP 실험당 더 적은 수의 셀이 LiDEP 칩의 마이크로채널 내에서 교류 전기장의 영향을 경험했습니다. 시간 경과에 따른 장치 성능의 변화(즉, 2시간 또는 3시간)로 인해 추가 불일치가 발생할 수 있으며, 이는 아직 조사 중입니다. 물, 에탄올 및 DEP 버퍼 용액의 일정한 흐름은 마이크로 채널 층 (즉, 광전도성 물질)의 표면을 분해 할 수 있으므로 고려해야합니다. 셀 특성화를 위한 시간 경과에 따른 장치 성능도 하나의 LiDEP 칩의 확장된 사용을 위해 고려해야 합니다. 실험 파라미터를 실시간으로 수정하는 데는 몇 초에서 몇 분밖에 걸리지 않았습니다. 전극 색상과 형상은 그래픽 편집기 소프트웨어 내의 설정을 사용하여 즉시 조정되었습니다.
요약하면, 이 논문은 hMSC와 같은 이질적인 세포 집단을 가진 세포주를 조작하고 특성화하는 LiDEP의 능력을 보여줍니다. 이 설정과 설명된 프로토콜을 사용하여 20Vpp 및 투영된 가상 노란색 전극 조건에서 hMSC의 성공적인 특성화를 달성할 수 있었습니다. 향후 연구는 LiDEP를 통해 생성된 AC 전기장에 대한 hMSC의 노출 시간을 조정하고, 가상 전극의 광도를 증가시키고, hMSC(또는 다른 줄기 세포 집단)의 다양한 소스를 평가하여 이종 줄기 세포 집단의 전기적 서명에 대한 LiDEP 카탈로그를 개발하는 데 초점을 맞춰야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 CBET를 통해 국립 과학 재단 CAREER 상 (2048221)의 지원을 받았습니다. UCI의 통합 나노 시스템 연구 시설 (INRF)의 Mo Kebaili에게 감사드립니다. 또한 LiDEP 시스템 개발을 지원해 주신 Devin Keck 박사님께 감사드립니다.
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
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