Her præsenterer vi lysinduceret dielektroforese som en etiketfri tilgang til karakterisering af heterogene cellelinjer, specifikt humane mesenkymale stamceller (hMSC’er). Dette papir beskriver en protokol til brug og optimering af en mikrofluidisk enhed med et fotoledende lag til at karakterisere hMSC’ers elektriske opførsel uden at ændre deres oprindelige tilstand.
Humane mesenkymale stamceller (hMSC’er) tilbyder en patientafledt cellekilde til gennemførelse af mekanistiske undersøgelser af sygdomme eller til flere terapeutiske anvendelser. Forståelse af hMSC-egenskaber, såsom deres elektriske adfærd på forskellige modningsstadier, er blevet vigtigere i de senere år. Dielektroforese (DEP) er en metode, der kan manipulere celler i et uensartet elektrisk felt, hvorigennem der kan opnås information om cellernes elektriske egenskaber, såsom cellemembranens kapacitans og permittivitet. Traditionelle former for DEP bruger metalelektroder, såsom tredimensionelle elektroder, til at karakterisere cellernes respons på DEP. I dette papir præsenterer vi en mikrofluidisk enhed bygget med et fotoledende lag, der er i stand til at manipulere celler gennem lysprojektioner, der fungerer som in situ virtuelle elektroder med let overensstemmende geometrier. En protokol præsenteres her, der demonstrerer dette fænomen, kaldet lysinduceret DEP (LiDEP), til karakterisering af hMSC’er. Vi viser, at LiDEP-inducerede celleresponser, målt som cellehastigheder, kan optimeres ved hjælp af forskellige parametre såsom indgangsspændingen, bølgelængdeområderne for lysprojektionerne og lyskildens intensitet. I fremtiden forestiller vi os, at denne platform kan bane vejen for teknologier, der er etiketfri og udfører karakterisering i realtid af heterogene populationer af hMSC’er eller andre stamcellelinjer.
Humane mesenkymale stamceller (hMSC’er) er anerkendt for deres immunsuppressive egenskaber1, hvilket har ført til deres anvendelse i terapi til behandling af en række sygdomme, såsom type II-diabetes2, graft versus værtssygdom3 og leversygdom4. HMSC’er er heterogene og indeholder underpopulationer af celler, der differentierer sig til adipocytter, chondrocytter og osteoblaster. HMSC’er er afledt af fedtvæv, navlesnorsvæv og knoglemarv, og deres differentieringspotentiale afhænger af oprindelsesvævet og den anvendte cellekulturproces5. For eksempel, ifølge en undersøgelse af Sakaguchi et al., hMSC’er afledt af fedtvæv er mere tilbøjelige til at differentiere sig til adipocytter, mens hMSC’er afledt af knoglemarv er mere tilbøjelige til at differentiere sig til osteocytter6. Virkningen af hMSC’ers vævsoprindelse på deres differentieringspotentiale er imidlertid et fænomen, der stadig mangler at blive forstået yderligere. Derudover bidrager hMSC’ernes varierede differentieringspotentialer til deres iboende heterogenitet og skaber udfordringer ved anvendelse af hMSC’er til terapi. Som sådan er karakterisering såvel som sortering af heterogene stamcellelinjer afgørende for udviklingen af in vitro og klinisk anvendelse af disse celler. Flowcytometri, guldstandardteknikken til undersøgelse af forskelle i cellulære fænotyper, bruger celleoverfladeantigener og fluorescerende farvestoffer til at mærke målceller og karakterisere dem baseret på lysspredning eller cellespecifikke fluorescensegenskaber 6,7,8. Ulemperne ved denne metode inkluderer den begrænsede tilgængelighed af antigenbiomarkører på celleoverfladen, de høje omkostninger ved udstyr og drift og det faktum, at celleoverfladefarvning potentielt kan beskadige cellemembranen og påvirke terapeutiske anvendelser 9,10,11. Derfor kan udforskning af nye teknikker til cellekarakterisering uden at gå på kompromis med cellemembranens oprindelige tilstand gavne den kliniske ydeevne af stamcelleterapi.
Dielektroforese (DEP), en metode til cellekarakterisering, der ikke bruger overfladeetiketter, er fokus for dette nuværende arbejde. DEP er en etiketfri eller ikke-farvningsmetode implementeret på mikrofluidiske platforme for at karakterisere heterogene populationer af celler baseret på deres elektriske egenskaber. DEP bruger et vekselstrømsfelt (AC) til erstatning for fluorescensfarvning (dvs. en etiketbaseret metode)7. De andre fordele ved at bruge DEP-baserede mikrofluidiske enheder til cellekarakterisering inkluderer brugen af små mængder (mikroliter), hurtig analysetid, minimale krav til forberedelse af celleprøver, minimal risiko for prøvekontaminering, minimal affaldsproduktion og lave omkostninger12,13. En anden fordel ved DEP er realtidsovervågning af celler14,15,16. For DEP udsættes celler i suspension for et uensartet vekselstrømsfelt skabt med elektroder, og de bliver polariserede6. Denne polarisering forårsager cellebevægelse og tillader cellemanipulation baseret på frekvensen og spændingen af det påførte vekselstrømsfelt. Ved at justere frekvensen, typisk mellem 5 kHz og 20 MHz, kan celler tiltrækkes eller frastødes væk fra elektroderne, svarende til henholdsvis positiv og negativ DEP-adfærd6.
Der er flere tilstande af DEP-karakterisering, nemlig traditionel, feltstrømfraktionering og lysinduceret, som klassificeret efter deres elektrodekonfiguration og / eller driftsstrategi17. 3DEP-analysatoren, en traditionel tilstand af DEP, inkorporerer fysiske metalelektroder og overvåger det cellulære respons på et vekselstrømsfelt. Dette system bruger en chip bestående af mikrobrønde med flere tredimensionelle cirkulære elektroder og registrerer ændringer i lysintensiteter for at karakterisere celle DEP-adfærd 18,19,20,21. Positiv DEP observeres som cellerne, der bevæger sig mod kanterne af de cirkulære elektroder langs mikrobrøndens vægge, hvilket resulterer i øget lysintensitet i midten af mikrobrønden. Negativ DEP observeres som celler, der klynger sig i midten af mikrobrønden væk fra de cirkulære elektroder, hvilket resulterer i nedsat lysintensitet i midten af mikrobrønden. Disse to fænomener er repræsenteret i figur 1. Traditionelle DEP-metoder har evnen til at karakterisere de elektriske egenskaber af heterogene cellepopulationer 18,20,21. For eksempel demonstrerede Mulhall et al. potentialet til at skelne mellem normale orale keratinocytter (HOK) og maligne orale keratinocyt (H357) cellelinjer baseret på forskelle i membrankapacitans21 ved anvendelse af 3DEP-analysatoren. En begrænsning af traditionelle tilstande af DEP er imidlertid den faste elektrodegeometri. Da hMSC’er er heterogene, er det en fordel at have mulighed for let at ændre elektrodegeometrierne under DEP-vurderinger. For eksempel gør det muligt at kunne ændre elektroderne eller elektrodearrayerne i realtid til enkeltcellefangst, at cellerne kan karakteriseres baseret på hastighed og DEP-adfærd. Anvendelsen af elektrodemodifikation i realtid i DEP-vurderinger af hMSC’er muliggør enkeltcelleanalyse af hMSC’er lige efter indkøb af dem fra prøvevævet for at karakterisere heterogeniteten af prøvepopulationen.
For at overvinde begrænsningen af traditionelle tilstande af DEP (dvs. faste fysiske elektroder) og udforske nye muligheder for realtidselektrodekonfigurationsændringer ved hjælp af DEP-fænomenet er lysinduceret DEP (LiDEP) blevet undersøgt. LiDEP er en ikke-traditionel tilstand af DEP, der manipulerer celler ved hjælp af en fotoledende mikrofluidisk enhed22,23 via lysfremskrivninger, lokaliserede elektroder skaber et uensartet elektrisk felt, svarende til den traditionelle DEP-metode. Denne tilgang giver også mulighed for fleksibilitet i elektrodegeometrien og for at flytte elektroderne i den mikrofluidiske enhed. Dette mindsker begrænsningen set med faste elektroder og giver mulighed for at få mere information om cellulær heterogenitet. LiDEP er blevet brugt til at detektere og analysere forskellige celletyper i homogene og heterogene populationer af celler22,23,24. For eksempel brugte Liao et al. LiDEP til at adskille cirkulerende tumorceller (CTC’er), der udtrykker epitelcelleadhæsionsmodulet (EpCAMneg) fra røde blodlegemer for at undersøge deres betydning i kræftmetastase22. Enkeltcelleanalyse med LiDEP er med succes blevet brugt til at karakterisere og manipulere kræftceller med stratificering af bugspytkirteltumorigenicitet23 og analyse af CTC’er i prøver før og efter metastase24.
Her beskriver vi, hvordan LiDEP kan bruges til at manipulere hMSC’er med en række elektrodegeometrier (cirkel-, diamant-, stjerne- og parallelle linjer) og systemindstillinger (anvendt spænding, lysintensitet og mikrofluidisk enhedsmateriale) og dermed tilbyde en tilgang til at karakterisere opførsel af menneskeafledte stamceller med virtuelle elektroder.
Undersøgelse af heterogeniteten af hMSC’er er vigtig for deres fremskridt inden for terapi. Dette arbejde giver et første skridt til at bruge LiDEP som et analytisk værktøj til vurdering af hMSC’er. Vi undersøgte spændingsafhængigheden af cellernes positive DEP-respons i LiDEP ved at kvantificere hastigheden. Det forventes, at højere spændinger skulle producere stærkere positiv DEP-kraft, og vi observerede dette mønster med de målte hastigheder. 10 V pp og 20 Vpp spændingerne var tilstrækkelige til manipulation af hMSC’er ved hjælp af LiDEP. Lavere spændinger (dvs. 5 Vpp) resulterede i langsommere celleresponser; Selvom det ikke er optimalt for hMSC’er, kan dette være fordelagtigt for andre celletyper. Der var et spændingsafhængigt fald i hMSC’ernes levedygtighed på ca. 9%. Dette adskiller sig lidt fra den tidligere litteratur 6,12,28,29, hvor brugen af traditionel DEP og LiDEP i undersøgelsen af biologiske celler ikke nedsatte cellens levedygtighed. Det eksperimentelle mål i hver undersøgelse varierede imidlertid. Glasser og Fuhr overvågede væksten af klæbende L929-musefibroblaster på metalelektroder i cellekulturmedium28. Omvendt undersøgte Lu et al. levedygtigheden af neurale stamceller udsat for vekselstrømselektriske felter i forskellige perioder12. Adams et al. karakteriserede de dielektriske egenskaber af hMSC’er med metalelektroder12, og Li et al. manipulerede leukæmiceller med LiDEP29. Forskellen mellem disse undersøgelser og vores var brugen af BSA, som kan være årsagen til det fald i levedygtighed, vi observerede. Den lavere samlede levedygtighed kan dog også skyldes den eksponeringstid (2 min 30 s), der anvendes i den protokol, der er fastlagt her. Denne gang blev valgt for at give tilstrækkelig tid til at visualisere cellemanipulation under eksponering for det uensartede vekselstrømsfelt.
Metoderne til cellekarakterisering blev testet via elektrodefarven for at bestemme mulighederne og begrænsningerne i vores LiDEP-system bygget som beskrevet i protokollen. I denne specifikke protokol kan elektrodefarven styres baseret på farven på den form, der projiceres gennem en grafisk editorfil. Vi brugte fire farver: hvid, gul, rød og blå. Fra effektudgangsaflæsningerne for hver farve blev de projicerede gule (#FFFF00) og hvide (#FFFFFF) elektroder målt til at have højere intensiteter, hvilket var grundlaget for, hvorfor disse farver var mere gunstige at bruge i de efterfølgende eksperimenter. På grund af den etablerede lysintensitetsafhængighed af fotoledende materialer30,31 tyder resultaterne desuden på, at ydeevnen for LiDEP-enheder er afhængig af fotoledende A: Si og kan indstilles ved valget af den projicerede elektrodefarve. En kombination af positive og negative DEP-responser fra hMSC’er blev også observeret ved anvendelse af LiDEP, hvilket er ligesom det fænomen, der ses i traditionelle DEP-metoder. Med hver elektrodefarve oplevede hMSC’erne negativ DEP-kraft, positiv DEP-kraft og cellerotation, hvilket indikerer, at celleprøven var heterogen ved en enkelt frekvens (supplerende video 1). Dette stemmer overens med resultaterne af Adams et al.6, at hMSC’er udviser både negativ og positiv DEP-adfærd ved en enkelt frekvens. Disse betingelser (elektrodefarve, elektrodeform og fotoledende materiale) kan tilvejebringe yderligere parametre til påvisning af heterogenitetsniveauet i hMSC-prøver.
Endelig blev resultaterne af LiDEP-vurderingen sammenlignet med resultaterne fra 3DEP-analysatoren som benchmark for hMSC DEP-adfærd. Der blev observeret en forskel i frekvensområdet for hMSC’ernes positive DEP-respons, men tendenserne i de data, der blev indsamlet via LiDEP og 3DEP-analysatoren, var generelt ens (dvs. det positive DEP-respons faldt med øget frekvens). Når det elektriske vekselstrømsfelt blev leveret til LiDEP-chippen, og lyset blev projiceret på det, faldt ledningsevnen i området inden for lysprojektionen, hvilket skabte et uensartet elektrisk felt. Derfor påvirker lyskildens egenskaber (dvs. intensitet og bølgelængde) den forventede respons af cellerne i LiDEP-chippen, set fra resultaterne af spændings- og elektrodefarvevariationstestene. Andre parametre, der kan ændres, er materialet i det fotokonduktive lag og ledningsevnen af DEP-bufferopløsningen. Som sådan skal de betingelser, der bruges til at evaluere cellernes DEP-adfærd, evalueres baseret på opsætningen af LiDEP-systemet. Omvendt er elektrodeegenskaberne konstante for 3DEP-analysatoren eller andre metoder, der bruger metalelektroder til at anvende DEP-kraften, og kan ikke varieres øjeblikkeligt for at tilpasse sig det, der er nødvendigt for de celler, der undersøges. Denne variation af den positive DEP-adfærd kan være gavnlig for fremtidig forskning i karakterisering af forskellige celletyper inden for hMSC-prøver, enkeltcelleanalyse eller cellesortering. Derudover, når cellerne bevæger sig længere væk fra de virtuelle elektroder, bliver AC-elektriske felt svagere. Men med 3DEP-analysatoren eller andre traditionelle DEP-tilstande, der bruger metalelektroder, kan der anvendes et større elektrisk feltområde, hvilket gør det muligt at manipulere flere celler. Derfor oplevede færre celler pr. LiDEP-eksperiment virkningerne af det vekselstrømselektriske felt inden for LiDEP-chippens mikrokanal. Yderligere uoverensstemmelser kan skyldes ændringer i enhedens ydeevne over tid (dvs. 2 timer eller 3 timer), som stadig undersøges. Den konstante strøm af vand, ethanol og DEP-bufferopløsning kan nedbryde overfladen af mikrokanallaget (dvs. det fotoledende materiale) og skal overvejes. Enhedens ydeevne over tid til cellekarakterisering skal også overvejes til udvidet brug af en LiDEP-chip. Ændringer af de eksperimentelle parametre i realtid tog kun et par sekunder til minutter. Elektrodefarven og geometrierne blev justeret øjeblikkeligt ved hjælp af indstillinger i grafikeditorsoftwaren.
Sammenfattende demonstrerer dette papir LiDEP’s evner til at manipulere og karakterisere en cellelinje med heterogene cellepopulationer såsom hMSC’er. Ved hjælp af denne opsætning og den beskrevne protokol var vi i stand til at opnå en vellykket karakterisering af hMSC’er under betingelserne for 20 Vpp og projicerede virtuelle gule elektroder. Fremtidige undersøgelser bør fokusere på at justere eksponeringstiden for hMSC’erne til det vekselstrømselektriske felt, der skabes via LiDEP, øge lysintensiteten af de virtuelle elektroder og vurdere forskellige kilder til hMSC’er (eller andre stamcellepopulationer) for at udvikle et LiDEP-katalog over de elektriske signaturer af heterogene stamcellepopulationer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation CAREER award (2048221) via CBET. Vi vil gerne takke Mo Kebaili fra UCI’s Integrated Nanosystems Research Facility (INRF). Derudover vil vi gerne takke Dr. Devin Keck for at hjælpe med udviklingen af LiDEP-systemet.
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
10x objective | AmScope | — | Ordered from Amazon. |
Amorphous silicon (A:Si) | Millipore Sigma | S5130 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9706-100 | |
Copper Tape | Zehhe | BF4964 | |
Dextrose | Fisher | D16-1 | This is glucose. |
Digital microscope | Keyence | VHX-7000 | |
Double Sided Tape | Insulectro | FLX000484 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
Fetel Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
Function Generator | Tektronix | AFG 31102 | |
Graphic editor software | Microsoft Office Powerpoint | — | |
Indium tin oxidec coated glass slides | MSE Supplied | GL0333 | |
L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | PCS-999-034 | |
Laptop | Dell | Inspiron 14, 2-in-1 | |
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium | ATCC | PCS-500-030 | |
Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs | ATCC | PCS-500-040 | |
Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X) | Giblo | A10490-01 | |
Molybdenum | Kurt J. Lesker | EJTMOXX352A4 | |
Phenol Red | Sigma | P5530 | |
Power Meter | Thor Labs | S130VC/PM400 | |
Projector | Vecupoi | — | Ordered from Amazon. |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Gibco | 11875-093 | This media has L-Glutamine and Phenol Red. |
Sucrose | Fisher | BP220-1 | |
Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | 0.40% |
Trypsin Neutrilizer | Gibco | R002100 | |
Vacuum Sputtering System | Denton | DV-502M |