Burada, ışığa bağlı dielektroforezi, heterojen hücre hatlarını, özellikle insan mezenkimal kök hücrelerini (hMSC’ler) karakterize etmek için etiketsiz bir yaklaşım olarak sunuyoruz. Bu makalede, hMSC’lerin doğal durumlarını değiştirmeden elektriksel davranışlarını karakterize etmek için fotoiletken bir tabakaya sahip bir mikroakışkan cihazın kullanılması ve optimize edilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.
İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC’ler), hastalıkların mekanik çalışmalarını yürütmek veya çeşitli terapötik uygulamalar için hasta kaynaklı bir hücre kaynağı sunar. Çeşitli olgunlaşma aşamalarındaki elektriksel davranışları gibi hMSC özelliklerinin anlaşılması son yıllarda daha önemli hale gelmiştir. Dielektroforez (DEP), hücre zarı kapasitansı ve geçirgenliği gibi hücrelerin elektriksel özellikleri hakkında bilgi edinilebilen, düzgün olmayan bir elektrik alanındaki hücreleri manipüle edebilen bir yöntemdir. Geleneksel DEP modları, hücrelerin DEP’ye tepkisini karakterize etmek için üç boyutlu elektrotlar gibi metal elektrotlar kullanır. Bu yazıda, kolayca uyumlu geometrilere sahip in situ sanal elektrotlar gibi davranan ışık projeksiyonları yoluyla hücreleri manipüle edebilen fotoiletken bir tabaka ile inşa edilmiş bir mikroakışkan cihaz sunuyoruz. Burada, hMSC’leri karakterize etmek için ışık kaynaklı DEP (LiDEP) adı verilen bu fenomeni gösteren bir protokol sunulmaktadır. Hücre hızları olarak ölçülen LiDEP kaynaklı hücre yanıtlarının, giriş voltajı, ışık projeksiyonlarının dalga boyu aralıkları ve ışık kaynağının yoğunluğu gibi değişen parametrelerle optimize edilebileceğini gösteriyoruz. Gelecekte, bu platformun etiketsiz teknolojilerin önünü açabileceğini ve hMSC’lerin veya diğer kök hücre hatlarının heterojen popülasyonlarının gerçek zamanlı karakterizasyonunu gerçekleştirebileceğini öngörüyoruz.
İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC’ler), tip II diyabet2, greft versus host hastalığı3 ve karaciğer hastalığı4 gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde terapötiklerde kullanılmalarına yol açan immünsüpresif özellikleri1 ile tanınmaktadır. HMSC’ler heterojendir ve adipositlere, kondrositlere ve osteoblastlara farklılaşan hücrelerin alt popülasyonlarını içerir. HMSC’ler yağ dokusu, göbek kordonu dokusu ve kemik iliğinden türetilir ve farklılaşma potansiyelleri orijin dokuya ve kullanılan hücre kültürü sürecine bağlıdır5. Örneğin, Sakaguchi ve ark. tarafından yapılan bir araştırmaya göre, yağ dokusundan türetilen hMSC’lerin adipositlere farklılaşma olasılığı daha yüksektir, oysa kemik iliğinden türetilen hMSC’lerin osteositlere farklılaşması daha olasıdır6. Bununla birlikte, hMSC’lerin doku kökeninin farklılaşma potansiyelleri üzerindeki etkisi, hala daha fazla anlaşılması gereken bir olgudur. Ek olarak, hMSC’lerin çeşitli farklılaşma potansiyelleri, doğal heterojenliklerine katkıda bulunur ve hMSC’lerin terapötikler için uygulanmasında zorluklar yaratır. Bu nedenle, heterojen kök hücre hatlarının karakterizasyonu ve sıralanması, bu hücrelerin in vitro ve klinik uygulamalarını geliştirmek için kritik öneme sahiptir. Hücresel fenotiplerdeki farklılıkları incelemek için altın standart teknik olan akış sitometrisi, hedef hücreleri etiketlemek ve ışık saçılması veya hücreye özgü floresan özelliklerine göre karakterize etmek için hücre yüzeyi antijenlerini ve floresan boyaları kullanır 6,7,8. Bu yöntemin dezavantajları, hücre yüzeyi antijen biyobelirteçlerinin sınırlı mevcudiyeti, ekipman ve operasyonun yüksek maliyeti ve hücre yüzeyi boyamasının hücre zarına potansiyel olarak zarar verebileceği ve terapötik uygulamaları etkileyebileceği gerçeğini içerir 9,10,11. Bu nedenle, hücresel zarın doğal durumundan ödün vermeden hücre karakterizasyonu için yeni tekniklerin araştırılması, kök hücre terapötiklerinin klinik performansına fayda sağlayabilir.
Yüzey etiketleri kullanmayan bir hücre karakterizasyonu yöntemi olan dielektroforez (DEP), bu güncel çalışmanın odak noktasıdır. DEP, heterojen hücre popülasyonlarını elektriksel özelliklerine göre karakterize etmek için mikroakışkan platformlarda uygulanan etiketsiz veya lekelenmeyen bir yöntemdir. DEP, floresan boyamanın yerine alternatif akım (AC) elektrik alanı kullanır (yani, etiket tabanlı bir yöntem)7. Hücre karakterizasyonu için DEP tabanlı mikroakışkan cihazların kullanılmasının diğer avantajları arasında küçük hacimlerin (mikrolitre) kullanılması, hızlı analiz süresi, minimum hücre numunesi hazırlama gereksinimleri, minimum numune kontaminasyonu riski, minimum atık üretimi ve düşük maliyetli12,13 yer almaktadır. DEP’nin bir diğer yararı,14,15,16 hücrelerinin gerçek zamanlı izlenmesidir. DEP için, süspansiyondaki hücreler elektrotlarla oluşturulan düzgün olmayan bir AC elektrik alanına maruz kalır ve polarize olurlar6. Bu polarizasyon hücre hareketine neden olur ve uygulanan AC elektrik alanının frekansına ve voltajına bağlı olarak hücre manipülasyonuna izin verir. Frekansı, tipik olarak 5 kHz ila 20 MHz arasında ayarlayarak, hücreler sırasıyla pozitif ve negatif DEP davranışına karşılık gelen elektrotlara çekilebilir veya elektrotlardan uzaklaştırılabilir6.
DEP karakterizasyonunun birden fazla modu vardır, yani elektrot konfigürasyonu ve / veya operasyonel stratejileri17 ile sınıflandırıldığı gibi, geleneksel, alan akışı fraksiyonasyonu ve ışık kaynaklı olarak. Geleneksel bir DEP modu olan 3DEP analizörü, fiziksel metal elektrotları içerir ve bir AC elektrik alanına hücresel yanıtı izler. Bu sistem, birden fazla üç boyutlu dairesel elektrotlu mikro kuyucuklardan oluşan bir çip kullanır ve hücre DEP davranışını karakterize etmek için ışık yoğunluklarındaki değişiklikleri tespit eder 18,19,20,21. Pozitif DEP, hücreler mikro kuyunun duvarları boyunca dairesel elektrotların kenarlarına doğru hareket ettikçe gözlenir ve bu da mikro kuyucuğun merkezinde artan ışık yoğunluğuna neden olur. Negatif DEP, mikro kuyunun merkezinde dairesel elektrotlardan uzakta kümelenen hücreler olarak gözlenir ve bu da mikro kuyucuğun merkezinde ışık yoğunluğunun azalmasına neden olur. Bu iki fenomen Şekil 1’de temsil edilmektedir. Geleneksel DEP yöntemleri, heterojen hücre popülasyonlarının elektriksel özelliklerini karakterize etme yeteneğine sahiptir 18,20,21. Örneğin, Mulhall ve ark., 3DEP analizörünü kullanarak membran kapasitans21’deki farklılıklara dayanarak normal oral keratinositler (HOK) ve malign oral keratinosit (H357) hücre hatları arasında ayrım yapma potansiyelini göstermiştir. Bununla birlikte, geleneksel DEP modlarının bir sınırlaması sabit elektrot geometrisidir. hMSC’ler heterojen olduğundan, DEP değerlendirmeleri sırasında elektrot geometrilerini kolayca değiştirme yeteneğine sahip olmak avantajlıdır. Örneğin, tek hücreli yakalama için elektrotları veya elektrot dizilerini gerçek zamanlı olarak değiştirebilmek, hücrelerin hız ve DEP davranışına göre karakterize edilmesini sağlar. hMSC’lerin DEP değerlendirmelerinde gerçek zamanlı elektrot modifikasyonunun uygulanması, numune popülasyonunun heterojenliğini karakterize etmek için hMSC’lerin numune dokusundan tedarik edildikten hemen sonra tek hücreli analizine izin verir.
Geleneksel DEP modlarının (yani, sabit fiziksel elektrotlar) sınırlamasının üstesinden gelmek ve DEP fenomenini kullanarak gerçek zamanlı elektrot konfigürasyon modifikasyonları için yeni fırsatları keşfetmek için, ışık kaynaklı DEP (LiDEP) araştırılmıştır. LiDEP, ışık projeksiyonları yoluyla fotoiletken bir mikroakışkan cihaz22,23 kullanarak hücreleri manipüle eden geleneksel olmayan bir DEP modudur, lokalize elektrotlar geleneksel DEP yöntemine benzer şekilde düzgün olmayan bir elektrik alanı oluşturur. Bu yaklaşım aynı zamanda elektrot geometrisinde esneklik ve elektrotların mikroakışkan cihaz içinde hareket ettirilmesini sağlar. Bu, sabit elektrotlarla görülen sınırlamayı hafifletir ve hücresel heterojenite hakkında daha fazla bilgi edinme fırsatı sağlar. LiDEP, homojen ve heterojen hücre popülasyonlarında farklı hücre tiplerini tespit etmek ve analiz etmek için kullanılmıştır22,23,24. Örneğin, Liao ve ark., epitel hücresi adezyon modülünü (EpCAMneg) eksprese eden dolaşımdaki tümör hücrelerini (CTC’ler) kanser metastazı22’deki önemini araştırmak için kırmızı kan hücrelerinden ayırmak için LiDEP’yi kullandılar. LiDEP ile tek hücreli analiz, pankreas tümörijenisitesinintabakalaşması 23 ve metastaz öncesi ve sonrası örneklerde CTC’lerin analizi ile kanser hücrelerini karakterize etmek ve manipüle etmek için başarıyla kullanılmıştır24.
Burada, LiDEP’in hMSC’leri çeşitli elektrot geometrileri (daire, elmas, yıldız ve paralel çizgiler) ve sistem ayarlarıyla (uygulanan voltaj, ışık yoğunluğu ve mikroakışkan cihaz malzemesi) manipüle etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz, böylece insan kaynaklı kök hücrelerin davranışını sanal elektrotlarla karakterize etmek için bir yaklaşım sunuyoruz.
HCSC’lerin heterojenliğinin incelenmesi, terapötiklerdeki ilerlemeleri için önemlidir. Bu çalışma, LiDEP’i hMSC’lerin değerlendirilmesi için analitik bir araç olarak kullanmak için ilk adımı sağlar. LiDEP’deki hücrelerin pozitif DEP yanıtının voltaj bağımlılığını, hızı ölçerek inceledik. Daha yüksek gerilimlerin daha güçlü pozitif DEP kuvveti üretmesi bekleniyor ve bu paterni ölçülen hızlarla gözlemledik. 10 V pp ve 20 Vpp voltajlar, LiDEP kullanılarak hMSC’lerin manipülasyonu için yeterliydi. Düşük voltajlar (yani, 5 Vpp) daha yavaş hücre tepkileriyle sonuçlandı; hMSC’ler için optimal olmasa da, bu diğer hücre tipleri için avantajlı olabilir. hMSC’lerin yaşayabilirliğinde voltaja bağlı olarak yaklaşık% 9’luk bir azalma vardı. Bu, biyolojik hücrelerin incelenmesinde geleneksel DEP ve LiDEP kullanımının hücre canlılığını azaltmadığı önceki literatür 6,12,28,29’dan biraz farklıdır. Bununla birlikte, her çalışmada deneysel amaç değişmiştir. Glasser ve Fuhr, hücre kültürü ortamı28’deki metal elektrotlar üzerinde yapışkan L929 fare fibroblastlarının büyümesini izledi. Tersine, Lu ve ark. AC elektrik alanlarına farklı süreler boyunca maruz kalan nöral kök hücrelerin yaşayabilirliğini incelemişlerdir12. Adams ve ark. hMSC’lerin dielektrik özelliklerini metal elektrotlar12 ile karakterize ettiler ve Li ve ark. Lösemi hücrelerini LiDEP29 ile manipüle ettiler. Bu çalışmalarla bizim aramızdaki fark, gözlemlediğimiz canlılıktaki azalmanın nedeni olabilecek BSA kullanımıydı. Bununla birlikte, daha düşük genel canlılık, burada oluşturulan protokolde kullanılan maruz kalma süresinden (2 dakika 30 sn) de kaynaklanabilir. Bu süre, düzgün olmayan AC elektrik alanına maruz kalma sırasında hücre manipülasyonunu görselleştirmek için yeterli zaman sağlamak için seçildi.
Hücre karakterizasyonu yöntemleri, protokolde açıklandığı gibi inşa edilen LiDEP sistemimizin yeteneklerini ve sınırlamalarını belirlemek için elektrot rengi aracılığıyla test edilmiştir. Bu özel protokolde, elektrot rengi, bir grafik düzenleyici dosyası aracılığıyla yansıtılan şeklin rengine göre kontrol edilebilir. Dört renk kullandık: beyaz, sarı, kırmızı ve mavi. Her renk için güç çıkışı okumalarından, öngörülen sarı (#FFFF00) ve beyaz (#FFFFFF) elektrotların daha yüksek yoğunluklara sahip olduğu ölçüldü, bu da bu renklerin sonraki deneylerde kullanılmasının neden daha uygun olduğunun temelini oluşturdu. Ek olarak, fotoiletken malzemelerin30,31 ışık yoğunluğuna bağımlılığı nedeniyle, sonuçlar LiDEP cihazlarının performansının fotoiletken A: Si’ye dayandığını ve yansıtılan elektrot renginin seçimi ile ayarlanabileceğini göstermektedir. HMSC’lerin pozitif ve negatif DEP yanıtlarının bir kombinasyonu, geleneksel DEP yöntemlerinde görülen fenomene benzeyen LiDEP kullanılarak da gözlenmiştir. Her elektrot renginde, hMSC’ler negatif DEP kuvveti, pozitif DEP kuvveti ve hücre rotasyonu yaşadı, bu da hücre örneğinin tek bir frekansta heterojen olduğunu gösterdi (Ek Video 1). Bu, Adams ve ark.6’nın hMSC’lerin tek bir frekansta hem negatif hem de pozitif DEP davranışı sergilediği bulgularıyla aynı fikirdedir. Bu koşullar (elektrot rengi, elektrot şekli ve fotoiletken malzeme), hMSC numunelerinde heterojenlik seviyesini tespit etmek için ek parametreler sağlayabilir.
Son olarak, LiDEP değerlendirmesinin sonuçları, hMSC DEP davranışının bir ölçütü olarak 3DEP analizöründen elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır. hMSC’lerin pozitif DEP yanıtının frekans aralığında bir fark gözlendi, ancak LiDEP ve 3DEP analizörü aracılığıyla toplanan verilerdeki eğilimler genel olarak benzerdi (yani, pozitif DEP yanıtı artan frekansla azaldı). AC elektrik alanı LiDEP çipine verildiğinde ve üzerine ışık yansıtıldığında, ışık projeksiyonu içindeki alandaki iletkenlik düştü ve düzgün olmayan bir elektrik alanı oluşturdu. Bu nedenle, ışık kaynağının özellikleri (yani, yoğunluk ve dalga boyu), voltaj ve elektrot renk değişimi testlerinin sonuçlarından görüldüğü gibi, LiDEP çipi içindeki hücrelerin beklenen tepkisini etkiler. Değiştirilebilen diğer parametreler, fotoiletken tabakanın malzemesi ve DEP tampon çözeltisinin iletkenliğidir. Bu nedenle, hücrelerin DEP davranışını değerlendirmek için kullanılan koşullar, LiDEP sisteminin kurulumuna göre değerlendirilmelidir. Tersine, 3DEP analizörü veya DEP kuvvetini uygulamak için metal elektrotlar kullanan diğer yöntemler için, elektrot özellikleri sabittir ve incelenen hücreler için gerekli olana uyum sağlamak için anında değiştirilemez. Pozitif DEP davranışının bu varyasyonu, hMSC örnekleri, tek hücreli analiz veya hücre sıralama içindeki farklı hücre tiplerinin karakterizasyonuna yönelik gelecekteki araştırmalar için yararlı olabilir. Ek olarak, hücreler sanal elektrotlardan uzaklaştıkça, AC elektrik alanı zayıflar. Bununla birlikte, 3DEP analizörü veya metal elektrotlar kullanan diğer geleneksel DEP modlarıyla, daha fazla hücrenin manipüle edilmesine izin veren daha büyük bir elektrik alanı bölgesi uygulanabilir. Bu nedenle, LiDEP deneyi başına daha az hücre, LiDEP çipinin mikro kanalı içindeki AC elektrik alanının etkilerini yaşadı. Daha fazla tutarsızlık, halen araştırılmakta olan zaman içinde cihaz performansındaki değişikliklerden (yani, 2 saat veya 3 saat) kaynaklanabilir. Su, etanol ve DEP tampon çözeltisinin sürekli akışı, mikrokanal tabakasının yüzeyini (yani fotoiletken malzemeyi) parçalayabilir ve dikkate alınması gerekir. Hücre karakterizasyonu için zaman içindeki cihaz performansının, bir LiDEP yongasının uzun süreli kullanımı için de dikkate alınması gerekir. Deneysel parametrelerde gerçek zamanlı olarak yapılan değişiklikler sadece birkaç saniye ila birkaç dakika sürdü. Elektrot rengi ve geometrileri, grafik düzenleyici yazılımındaki ayarlar kullanılarak anında ayarlandı.
Özetle, bu makale LiDEP’in hMSC’ler gibi heterojen hücre popülasyonlarına sahip bir hücre hattını manipüle etme ve karakterize etme yeteneklerini göstermektedir. Bu kurulumu ve açıklanan protokolü kullanarak, 20 Vpp ve öngörülen sanal sarı elektrotlar koşulları altında hMSC’lerin başarılı bir şekilde karakterize edilmesini sağladık. Gelecekteki çalışmalar, hMSC’lerin LiDEP aracılığıyla oluşturulan AC elektrik alanına maruz kalma süresini ayarlamaya, sanal elektrotların ışık yoğunluğunu artırmaya ve heterojen kök hücre popülasyonlarının elektriksel imzalarının bir LiDEP kataloğunu geliştirmek için farklı hMSC kaynaklarını (veya diğer kök hücre popülasyonlarını) değerlendirmeye odaklanmalıdır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, CBE aracılığıyla Ulusal Bilim Vakfı KARİYER ödülü (2048221) tarafından desteklenmiştir. UCI’nin Entegre Nanosistemler Araştırma Tesisi’nden (INRF) Mo Kebaili’ye teşekkür ederiz. Ek olarak, LiDEP sisteminin geliştirilmesine yardımcı olduğu için Dr. Devin Keck’e teşekkür ederiz.
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
10x objective | AmScope | — | Ordered from Amazon. |
Amorphous silicon (A:Si) | Millipore Sigma | S5130 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9706-100 | |
Copper Tape | Zehhe | BF4964 | |
Dextrose | Fisher | D16-1 | This is glucose. |
Digital microscope | Keyence | VHX-7000 | |
Double Sided Tape | Insulectro | FLX000484 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
Fetel Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
Function Generator | Tektronix | AFG 31102 | |
Graphic editor software | Microsoft Office Powerpoint | — | |
Indium tin oxidec coated glass slides | MSE Supplied | GL0333 | |
L-Alanyl-L-Glutamine | ATCC | PCS-999-034 | |
Laptop | Dell | Inspiron 14, 2-in-1 | |
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium | ATCC | PCS-500-030 | |
Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs | ATCC | PCS-500-040 | |
Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X) | Giblo | A10490-01 | |
Molybdenum | Kurt J. Lesker | EJTMOXX352A4 | |
Phenol Red | Sigma | P5530 | |
Power Meter | Thor Labs | S130VC/PM400 | |
Projector | Vecupoi | — | Ordered from Amazon. |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Gibco | 11875-093 | This media has L-Glutamine and Phenol Red. |
Sucrose | Fisher | BP220-1 | |
Trypan Blue Stain | Gibco | 15250-061 | 0.40% |
Trypsin Neutrilizer | Gibco | R002100 | |
Vacuum Sputtering System | Denton | DV-502M |