Analisi dell'isolamento e del trascrittoma di tipi di cellule vegetali
Summary
La fattibilità e l’efficacia dei metodi scRNA-seq ad alto rendimento annunciano un’era a singola cellula nella ricerca sulle piante. Presentata qui è una procedura robusta e completa per isolare specifici tipi di cellule radice di Arabidopsis thaliana e la successiva costruzione e analisi della libreria di trascrittomi.
Abstract
Negli organismi multicellulari, la programmazione dello sviluppo e le risposte ambientali possono essere altamente divergenti in diversi tipi di cellule o anche all’interno delle cellule, che è noto come eterogeneità cellulare. Negli ultimi anni, l’isolamento di singole cellule e di tipo cellulare combinato con tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) sono diventati strumenti importanti per studiare i processi biologici a risoluzione singola cellulare. Tuttavia, isolare le cellule vegetali è relativamente più difficile a causa della presenza di pareti cellulari vegetali, che limita l’applicazione di approcci unicellulari nelle piante. Questo protocollo descrive una solida procedura per l’isolamento basato su cellule singole e cellulari attivate da fluorescenza (FACS) con cellule vegetali, adatta per l’analisi multi-omica a valle e altri studi. Utilizzando le linee marcatrici fluorescenti della radice di Arabidopsis , dimostriamo come particolari tipi di cellule, come le cellule del periciclo xilematico-polo, le cellule iniziali della radice laterale, le cellule del cappuccio radicale laterale, le cellule della corteccia e le cellule endodermiche, sono isolate. Inoltre, viene fornito anche un efficace metodo di analisi del trascrittoma a valle utilizzando Smart-seq2. Il metodo di isolamento cellulare e le tecniche di analisi del trascrittoma possono essere adattati ad altri tipi di cellule e specie vegetali e hanno un ampio potenziale applicativo nella scienza delle piante.
Introduction
Le cellule sono l’unità fondamentale di tutti gli organismi viventi e svolgono funzioni strutturali e fisiologiche. Sebbene le cellule negli organismi multicellulari mostrino un’apparente sincronicità, cellule di diversi tipi e singole cellule presentano differenze nei loro trascrittomi durante lo sviluppo e le risposte ambientali. Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula ad alto rendimento (scRNA-seq) fornisce una potenza senza precedenti per comprendere l’eterogeneità cellulare. L’applicazione di scRNA-seq nelle scienze vegetali ha contribuito a costruire con successo un atlante cellularevegetale 1, è stato utilizzato per identificare taxa cellulari rari nei tessuti vegetali2, ha fornito informazioni sulla composizione dei tipi di cellule nei tessuti vegetali ed è stato utilizzato per identificare l’identità cellulare e importanti funzioni impiegate durante lo sviluppo e la differenziazione delle piante. Inoltre, è possibile dedurre traiettorie di sviluppo spazio-temporali nei tessuti vegetali 1,2,3 per scoprire nuovi geni marcatori4 e studiare le funzioni di importanti fattori di trascrizione 5 utilizzando scRNA-seq al fine di rivelare la conservazione evolutiva dello stesso tipo cellulare in piante diverse 3. Gli stress abiotici sono tra le più importanti influenze ambientali sulla crescita e lo sviluppo delle piante. Esplorando i cambiamenti nella composizione dei tipi di cellule nei tessuti vegetali in diverse condizioni di trattamento attraverso il sequenziamento del trascrittoma a singola cellula, si può anche risolvere il meccanismo di risposta allo stress abiotico6.
Il potenziale per risolvere l’eterogeneità trascrizionale tra i tipi di cellule utilizzando il sequenziamento scRNA dipende dal metodo di isolamento cellulare e dalla piattaforma di sequenziamento. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) è una tecnica ampiamente utilizzata per isolare una sottopopolazione di cellule per scRNA-seq basata sulla diffusione della luce e sulle proprietà di fluorescenza delle cellule. Lo sviluppo di linee di marcatori fluorescenti mediante tecnologia transgenica ha notevolmente migliorato l’efficienza dell’isolamento cellulare mediante FACS7. Condurre scRNA-seq usando Smart-seq28 migliora ulteriormente la capacità di sezionare l’eterogeneità cellulare. Il metodo Smart-seq2 ha una buona sensibilità per il rilevamento genico e può rilevare geni anche con un basso input di trascrizione9. Oltre alla raccolta di tipi di cellule di massa, i moderni selezionatori di cellule forniscono un formato di ordinamento dell’indice a singola cellula, consentendo l’analisi del trascrittoma a risoluzione di singola cellula utilizzando Smart-seq210 o altri metodi multiplexed RNA-seq, come CEL-seq211. La selezione a cella singola o a cella può essere potenzialmente utilizzata per molte altre applicazioni a valle, come gli studi multiomici paralleli12,13. Presentato qui è un protocollo robusto e versatile per isolare i tipi di cellule vegetali, come le cellule del periciclo xilematico-polo, le cellule del cappuccio della radice laterale, le cellule iniziali della radice laterale, le cellule della corteccia e le cellule endodermiche dalle radici delle linee cellulari marcatrici di Arabidopsis thaliana mediante FACS. Il protocollo prevede inoltre la costruzione della libreria Smart-seq2 per l’analisi del trascrittoma a valle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo basato su Smart-seq2 può generare librerie di sequenziamento affidabili da diverse centinaia di celle8. La qualità del materiale di partenza è essenziale per l’accuratezza dell’analisi del trascrittoma. FACS è un potente strumento per la preparazione delle celle di interesse, ma questa procedura, in particolare la fase di protopertura, deve essere ottimizzata per le applicazioni dell’impianto. La microdissezione a cattura laser (LCM) o le cellule sezionate manualmente possono anc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Abbiamo istituito questo protocollo nella struttura multi-omica a cellula singola della School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, e siamo stati supportati dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) e Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
Referências
- Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell–derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
