בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח
Summary
ההיתכנות והיעילות של שיטות scRNA-seq בעלות תפוקה גבוהה מבשרות על עידן חד-תאי בחקר צמחים. מוצג כאן הליך חזק ומלא לבידוד סוגי תאי שורש ספציפיים של Arabidopsis thaliana ובנייה וניתוח של ספריית שעתוק לאחר מכן.
Abstract
באורגניזמים רב-תאיים, תכנות התפתחותי ותגובות סביבתיות יכולים להיות שונים מאוד בסוגי תאים שונים או אפילו בתוך תאים, מה שידוע בשם הטרוגניות תאית. בשנים האחרונות, בידוד תא בודד וסוג תא בשילוב עם טכניקות ריצוף הדור הבא (NGS) הפכו לכלים חשובים לחקר תהליכים ביולוגיים ברזולוציה של תא יחיד. עם זאת, בידוד תאי צמח הוא יחסית קשה יותר בשל נוכחותם של קירות תאי הצמח, אשר מגביל את היישום של גישות חד-תאיות בצמחים. פרוטוקול זה מתאר הליך חזק למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) המבוסס על בידוד תא בודד וסוג תא עם תאי צמחים, המתאים לניתוח מולטי-אומיקס במורד הזרם ולמחקרים אחרים. באמצעות שימוש בקווי סמן פלואורסצנטיים של שורש Arabidopsis אנו מדגימים כיצד סוגי תאים מסוימים, כגון תאי פריסייקל של קוטב קסילם, תאי שורש ראשוניים רוחביים, תאי כובע שורש רוחביים, תאי קליפת המוח ותאים אנדודרמליים, מבודדים. יתר על כן, שיטת ניתוח תמלול יעילה במורד הזרם באמצעות Smart-seq2 מסופקת גם כן. שיטת בידוד התאים וטכניקות ניתוח התעתיק ניתנות להתאמה לסוגי תאים אחרים ולמיני צמחים ויש להן פוטנציאל יישום רחב במדעי הצמח.
Introduction
תאים הם היחידה הבסיסית של כל האורגניזמים החיים ומבצעים פונקציות מבניות ופיזיולוגיות. למרות שהתאים באורגניזמים רב-תאיים מראים סינכרוניות לכאורה, תאים מסוגים שונים ותאים בודדים מציגים הבדלים בתעתיק שלהם במהלך ההתפתחות ובתגובות סביבתיות. ריצוף RNA חד-תאי בתפוקה גבוהה (scRNA-seq) מספק עוצמה חסרת תקדים להבנת הטרוגניות תאית. יישום scRNA-seq במדעי הצמח תרם לבנייה מוצלחת של אטלס תאי צמח1, שימש לזיהוי טקסים תאיים נדירים ברקמות צמח2, סיפק תובנה לגבי הרכב סוגי התאים ברקמות צמחים, ושימש לזיהוי זהות תאית ופונקציות חשובות המשמשות במהלך התפתחות והתמיינות צמחים. בנוסף, ניתן להסיק מסלולי התפתחות מרחביים-זמניים ברקמות צמחים 1,2,3 כדי לגלות גנים חדשים של סמן4 ולחקור את תפקודם של גורמי שעתוק חשובים5 באמצעות scRNA-seq כדי לחשוף את השימור האבולוציוני של אותו סוג תא בצמחים שונים3. עקה אביוטית היא בין ההשפעות הסביבתיות החשובות ביותר על גדילה והתפתחות של צמחים. על ידי חקירת השינויים בהרכב סוגי התאים ברקמות צמחים בתנאי טיפול שונים באמצעות ריצוף שעתוק חד-תאי, ניתן גם לפתור את מנגנון תגובת העקה הא-ביוטית6.
הפוטנציאל לפתרון הטרוגניות שעתוק בין סוגי תאים באמצעות ריצוף scRNA תלוי בשיטת בידוד התאים ובפלטפורמת הריצוף. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) היא טכניקה נפוצה לבידוד תת-אוכלוסייה של תאים עבור scRNA-seq בהתבסס על פיזור האור והתכונות הפלואורסצנטיות של התאים. פיתוח קווי סמן פלואורסצנטיים על ידי טכנולוגיה טרנסגנית שיפר מאוד את יעילות בידוד התאים על ידי FACS7. ביצוע scRNA-seq באמצעות Smart-seq28 משפר עוד יותר את היכולת לנתח את ההטרוגניות התאית. לשיטת Smart-seq2 יש רגישות טובה לזיהוי גנים והיא יכולה לזהות גנים גם עם קלט תעתיק נמוך9. בנוסף לאיסוף סוגי תאים בתפזורת, ממייני תאים מודרניים מספקים תבנית מיון אינדקס של תא יחיד, המאפשרת ניתוח תעתיק ברזולוציה של תא בודד באמצעות Smart-seq210 או שיטות RNA-seq מרובות אחרות, כגון CEL-seq211. מיון תא בודד או סוג תא יכול לשמש פוטנציאלית עבור יישומים רבים אחרים במורד הזרם, כגון מחקרי מולטי-אומיקה מקבילים12,13. מוצג כאן פרוטוקול חזק ורב-תכליתי לבידוד סוגי תאי צמחים, כגון תאי פריסייקל בקוטב קסילם, תאי כובע שורש רוחביים, תאי שורש ראשוניים רוחביים, תאי קליפת המוח ותאים אנדודרמליים משורשי קווי תאי סמן Arabidopsis thaliana על ידי FACS. הפרוטוקול כולל גם בניית ספריית Smart-seq2 לניתוח תמלול במורד הזרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול מבוסס Smart-seq2 יכול ליצור ספריות רצף אמינות מכמה מאות תאים8. איכות חומר המוצא חיונית לדיוק ניתוח התמלול. FACS הוא כלי רב עוצמה להכנת תאים מעניינים, אך הליך זה, במיוחד השלב הפרוטו-מתמשך, חייב להיות מותאם ליישומים צמחיים. מיקרודיסקציה ללכידת לייזר (LCM) או תאים מנותחים ידנית י…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הקמנו פרוטוקול זה במתקן הרב-תאי היחיד של בית הספר לחקלאות וביולוגיה, אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנחאי, ונתמכו על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס ‘32070608), תוכנית שנחאי פוג’יאנג (מענק מס ’20PJ1405800), ואוניברסיטת שנגחאי ג’יאו טונג (מענק מס ‘Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
Referências
- Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell–derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
