Isolering og transkriptomanalyse av plantecelletyper
Summary
Gjennomførbarheten og effektiviteten av scRNA-seq-metoder med høy gjennomstrømning varsler en enkeltcelle-epoke i planteforskning. Presentert her er en robust og komplett prosedyre for isolering av spesifikke Arabidopsis thaliana rotcelletyper og påfølgende transkriptombibliotekkonstruksjon og analyse.
Abstract
I multicellulære organismer kan utviklingsprogrammering og miljørespons være svært divergerende i forskjellige celletyper eller til og med i celler, som er kjent som cellulær heterogenitet. I de senere år har enkeltcelle- og celletypeisolasjon kombinert med neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS) blitt viktige verktøy for å studere biologiske prosesser ved encelleoppløsning. Imidlertid er isolering av planteceller relativt vanskeligere på grunn av tilstedeværelsen av plantecellevegger, noe som begrenser anvendelsen av enkeltcellede tilnærminger i planter. Denne protokollen beskriver en robust prosedyre for fluorescensaktivert cellesortering (FACS)-basert enkeltcelle- og celletypeisolasjon med planteceller, som er egnet for nedstrøms multi-omics-analyse og andre studier. Ved hjelp av Arabidopsis rotfluorescerende markørlinjer demonstrerer vi hvordan bestemte celletyper, som xylem-pol pericycle celler, laterale rot initialceller, laterale rot cap celler, cortex celler og endodermale celler, er isolert. Videre er det også gitt en effektiv nedstrøms transkriptomanalysemetode ved bruk av Smart-seq2. Celleisolasjonsmetoden og transkriptomanalyseteknikker kan tilpasses andre celletyper og plantearter og har et bredt anvendelsespotensial i plantevitenskap.
Introduction
Celler er den grunnleggende enheten i alle levende organismer og utfører strukturelle og fysiologiske funksjoner. Selv om cellene i flercellede organismer viser tilsynelatende synkronitet, presenterer celler av forskjellige typer og individuelle celler forskjeller i deres transkriptomer under utviklings- og miljøresponser. High-throughput enkeltcelle RNA-sekvensering (scRNA-seq) gir enestående kraft for å forstå cellulær heterogenitet. Bruk av scRNA-seq i plantevitenskap har bidratt til vellykket konstruksjon av et plantecelleatlas1, har blitt brukt til å identifisere sjeldne cellulære taxa i plantevev2, har gitt innsikt i sammensetningen av celletyper i plantevev, og har blitt brukt til å identifisere cellulær identitet og viktige funksjoner ansatt under planteutvikling og differensiering. I tillegg er det mulig å utlede spatiotemporale utviklingsbaner i plantevev 1,2,3 for å oppdage nye markørgener4 og studere funksjonene til viktige transkripsjonsfaktorer 5 ved hjelp av scRNA-seq for å avsløre evolusjonær bevaring av samme celletype i forskjellige planter 3. Abiotiske påkjenninger er blant de viktigste miljøpåvirkningene på plantevekst og utvikling. Ved å undersøke endringene i sammensetningen av celletyper i plantevev under ulike behandlingsbetingelser gjennom encellet transkriptomsekvensering, kan man også løse den abiotiske stressresponsmekanismen6.
Potensialet for å løse transkripsjonell heterogenitet mellom celletyper ved bruk av scRNA-sekvensering avhenger av celleisolasjonsmetoden og sekvenseringsplattformen. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) er en mye brukt teknikk for å isolere en underpopulasjon av celler for scRNA-seq basert på lysspredning og fluorescensegenskapene til cellene. Utviklingen av fluorescerende markørlinjer ved transgen teknologi har i stor grad forbedret effektiviteten av celleisolasjon av FACS7. Gjennomføring av scRNA-seq ved bruk av Smart-seq28 forbedrer ytterligere evnen til å dissekere den cellulære heterogeniteten. Smart-seq2-metoden har god sensitivitet for gendeteksjon og kan oppdage gener selv med lav transkripsjonsinngang9. I tillegg til bulkcelletypeinnsamling gir moderne cellesorterere et enkeltcelleindekssorteringsformat, noe som tillater transkriptomanalyse ved enkeltcelleoppløsning ved bruk av Smart-seq210 eller andre multipleksede RNA-seq-metoder, for eksempel CEL-seq211. Enkeltcelle- eller celletypesortering kan potensielt brukes til mange andre nedstrømsapplikasjoner, for eksempel parallelle multi-omics-studier12,13. Presentert her er en robust og allsidig protokoll for isolering av plantecelletyper, for eksempel xylem-pole pericycle celler, laterale rot cap celler, laterale rot initialceller, cortex celler og endodermale celler fra røttene til Arabidopsis thaliana markør cellelinjer av FACS. Protokollen innebærer videre å konstruere Smart-seq2-biblioteket for nedstrøms transkriptomanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den Smart-seq2-baserte protokollen kan generere pålitelige sekvenseringsbiblioteker fra flere hundre celler8. Kvaliteten på utgangsmaterialet er avgjørende for nøyaktigheten av transkriptomanalysen. FACS er et kraftig verktøy for å forberede celler av interesse, men denne prosedyren, spesielt protoplastingstrinnet, må optimaliseres for planteapplikasjoner. Laserfangstmikrodisseksjon (LCM) eller manuelle dissekerte celler kan også brukes som input25,26,<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi satte opp denne protokollen i single-cell multi-omics-anlegget ved School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, og ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 32070608), Shanghai Pujiang-programmet (Grant No. 20PJ1405800) og Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
Referências
- Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell–derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
