כימות עקה שכפול בתאי סרטן השחלות באמצעות אימונופלואורסנציה של DNA חד-גדילי
Summary
במאמר זה אנו מתארים שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות רמות הדנ”א החד-גדילי בתאים. שיטה יעילה וניתנת לשחזור זו יכולה לשמש לבחינת לחץ שכפול, תכונה נפוצה במספר סוגי סרטן השחלות. בנוסף, בדיקה זו תואמת צינור ניתוח אוטומטי, אשר מגביר עוד יותר את יעילותו.
Abstract
לחץ שכפול הוא סימן ההיכר של מספר סוגי סרטן השחלות. לחץ שכפול יכול לנבוע ממקורות מרובים, כולל הפסקות דו-גדיליות, התנגשויות שעתוק-שכפול או אונקוגנים מוגברים, וכתוצאה מכך באופן בלתי נמנע יצירת DNA חד-גדילי (ssDNA). כימות ssDNA, אם כן, מהווה הזדמנות להעריך את רמת לחץ השכפול בסוגי תאים שונים ובתנאים או טיפולים שונים הפוגעים בדנ”א. ראיות חדשות מצביעות גם על כך ש- ssDNA יכול להיות מנבא של תגובות לתרופות כימותרפיות המכוונות לתיקון DNA. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מפורטת המבוססת על אימונופלואורסנציה לכימות ssDNA. מתודולוגיה זו כוללת תיוג הגנום עם אנלוגי תימידין, ואחריו זיהוי מבוסס נוגדנים של האנלוגי בכרומטין בתנאים שאינם דנטורציה. ניתן לדמיין מתיחות של ssDNA כמוקדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מספר המוקדים ועוצמתם קשורים ישירות לרמת ssDNA הקיימת בגרעין. אנו גם מתארים צינור אוטומטי לכימות אות ssDNA. השיטה מהירה וניתנת לשחזור. יתר על כן, הפשטות של מתודולוגיה זו הופכת אותה למקובלת על יישומים בעלי תפוקה גבוהה כגון תרופות ובדיקות גנטיות.
Introduction
דנ”א גנומי חשוף לעתים קרובות להתקפות מרובות ממקורות אנדוגניים ואקסוגניים שונים1. תדירות הנזק האנדוגני נמצאת בקורלציה ישירה עם רמות תוצרי לוואי מטבוליים, כגון מיני חמצן תגובתי או אלדהידים, שהם גבוהים יותר באופן מהותי בסוגי סרטן מרובים, כולל סרטן השחלות 2,3. הכרחי שנזק לדנ”א ייפתר ביעילות; אחרת, זה יכול לטפח נגעים genotoxic, וכתוצאה מכך, מוטגנזה. יכולתם של תאים לתקן נגעים גנוטוקסיים תלויה בפונקציונליות של מסלולי תיקון דנ”א נטולי שגיאות ובוויסות יעיל של התקדמות מחזור התא בתגובה לנזק לדנ”א. יש לציין כי סרטני שחלות רבים נושאים מוטציות לא פעילות תפקודית ב-p53, ולכן יש להם מחסום G1/S פגום, מה שמוביל את התאים ליזום שכפול DNA למרות נוכחותם של נגעים גנומיים לא מתוקנים 4,5. מידת הנזק לדנ”א בסרטן השחלות מורכבת עוד יותר על ידי התצפית כי ליותר מ -50% מקרצינומת השחלות הסרוסיות בדרגה גבוהה (HGSOC) יש פגמים ברקומבינציה הומולוגית בתיווך BRCA1 ו- BRCA2, מסלול תיקון ה- DNA ללא שגיאות, וכ -20% יש הגברה בגן CCNE1, אשר דוחף בטרם עת תאי G1 לשלב S6 . יחד, התדירות הגבוהה של נזק אנדוגני לדנ”א, נקודות ביקורת פגומות ומסלולי תיקון לא תקינים מגבירים באופן אקספוננציאלי את הצטברות הנגעים הגנומיים בסרטן השחלות. נגעים אלה יכולים לשמש מכשולים להתקדמות של תהליכים תאיים קריטיים כגון שכפול DNA ושעתוק . כפי שיפורט להלן, מכשולים כאלה מזרזים את יצירת הדנ”א החד-גדילי (ssDNA) בתאים.
הסליל הכפול של הדנ”א הוא קריטי להגנה על הגנום מפני תהליכים מוטגניים מרובים, כגון דפורינציה ודפירימידינציה ספונטנית, פעילות של ציטוזין דיאמינאזות, ונזק חמצונילדנ“א 1,7. לעומת זאת, ssDNA פגיע מאוד לאירועים מוטציוניים אלה. תהליכים מרובים בתאים יכולים לגרום ליצירת ssDNA (איור 1). אלה כוללים את הדברים הבאים:
(i) עיכוב של מנגנון שכפול הדנ”א: זה מוביל לניתוק של מנחת המסוקים והפולימראז של הדנ”א, ומשאיר רצועות של ssDNA 8,9.
(ii) עיכוב של מנגנון השעתוק: עיכוב מתמשך של RNA פולימראז מוביל ליצירת מבני DNA/RNA היברידיים תלת-גדיליים הנקראים לולאות R. היווצרות לולאת R חושפת את הדנ”א העקור, שאינו משועתק, כגדיל יחיד10.
(iii) כריתת קצה דנ”א: התחלת תיקון מכוון הומולוגיה דורשת יצירה של ssDNA 3′ כדי לזרז את החיפוש אחר רצף הומולוגי11.
(iv) D-loop: פלישת גדיל במהלך רקומבינציה הומולוגית עלולה לגרום לתזוזה של הגדיל המשלים שאינו תבנית, וכתוצאה מכך ssDNA12.
(v) פערים מצומדים לשכפול: במהלך שכפול הדנ”א, סינתזת גדילים מפגרים מתרחשת באופן לא רציף, שבו מקטעי אוקזקי נוצרים תחילה ולאחר מכן קשירה. עיכוב או פגם בעיבוד מקטעי אוקזקי יכול גם לגרום להיווצרות ssDNA. לבסוף, אם מזלג השכפול על גדיל מוביל נתקל בנגע משתהה, DNA פולימראז ופרימאז, PRIMPOL יכול להוביל מחדש את הסינתזה במורד הזרם, ולהשאיר פער ssDNA מאחורי13,14.
ככל הנראה, רוב האירועים האלה מתרחשים כאשר מנגנון שכפול הדנ”א מתמודד עם נגעים גנומיים או במהלך תיקון מצומד שכפול, דבר המצביע על כך שנזק גבוה יותר לדנ”א מוביל לרמות גבוהות יותר של ssDNA. מכיוון שרבים מאירועים אלה קשורים לשכפול, היווצרות ssDNA נחשבת לסמן של “לחץ שכפול” בתאים15,16.
כאן, אנו מתארים בדיקה שניתן להשתמש בה כדי לכמת באופן אמין ssDNA בתאים. הפשטות, יכולת השחזור ויתרונות העלות של גישה זו הופכים אותה למקובלת לשימוש להערכת תגובת השכפול-עקה בתאים. מחקרים חדשים גילו כי רמת ssDNA יכולה גם לנבא תגובות לכימותרפיה, כגון מעכבי אנזימי PARP1/2, ATR וקינאז Wee1 17,18,19,20,21. מעכבים אלה נרדפים במשטר הטיפול של מספר HGSOCs22. לכן, בדיקה זו יכולה להיות גם כלי שימושי לחיזוי תגובות כימותרפיות בתאי סרטן השחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שהוזכר בפרוטוקול, חשוב לכלול כמה בקרות ניסיוניות כדי להבטיח שהבדיקה עובדת. אלה כוללים דגימה ללא טיפול ב- IdU וכן דגימה ללא נוגדנים ראשוניים. שתי הבקרות השליליות אמורות להניב תאים המוכתמים על-ידי DAPI אך אינם מכילים אות IdU.
בהתבסס על תנאי הניסוי וקווי התאים שבהם נעשה שימוש, יי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PV נתמכת על ידי מענק Pedal the Cause של מרכז הסרטן ע”ש אלווין ג’יי סייטמן באמצעות הקרן לבית החולים היהודי בארנס, מענק מחקר פיילוט ממרכז מרשה ריבקין לחקר סרטן השחלות, מענק לחקר הסרטן מקרן Mary Kay Ash וקרן V. NR נתמך על ידי מענק T32 להכשרת תאים וביולוגיה מולקולרית של NIH לאוניברסיטת וושינגטון, סנט לואיס.
Materials
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
Referências
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D’Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
- Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093 (2017).
- Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Patch, A. -. M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
- Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
- Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
- Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
- Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
- Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
- Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).
- Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574 (2021).
- Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA’s first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
- Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).
