Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Summary

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Abstract

A imagem com cálcio (Ca 2+) tem sido amplamente utilizada para examinar a atividade neuronal, mas está ficando cada vez mais claro que a manipulação subcelular de Ca²⁺ é um componente crucial da sinalização intracelular. A visualização da dinâmica subcelular de Ca²⁺ in vivo, onde os neurônios podem ser estudados em seus circuitos nativos e intactos, tem se mostrado tecnicamente desafiadora em sistemas nervosos complexos. A transparência e o sistema nervoso relativamente simples do nematoide Caenorhabditis elegans permitem a expressão célula-específica e a visualização in vivo de marcadores e marcadores fluorescentes. Entre eles estão indicadores fluorescentes que foram modificados para uso no citoplasma, bem como em vários compartimentos subcelulares, como as mitocôndrias. Este protocolo permite a obtenção de imagens não ratiométricas de Ca 2+ in vivo com uma resolução subcelular que permite a análise da dinâmica de Ca²⁺ até o nível de espinhas dendríticas individuais e mitocôndrias. Aqui, dois indicadores geneticamente codificados disponíveis com diferentes afinidades de Ca 2+ são usados para demonstrar o uso deste protocolo para medir os níveis relativos de Ca²⁺ dentro do citoplasma ou matriz mitocondrial em um único par de interneurônios excitatórios (AVA). Juntamente com as manipulações genéticas e observações longitudinais possíveis em C. elegans, este protocolo de imagem pode ser útil para responder a perguntas sobre como o manuseio de Ca²⁺ regula a função neuronal e a plasticidade.

Introduction

Os íons cálcio (Ca²⁺) são carreadores de informação altamente versáteis em muitos tipos celulares. Nos neurônios, o Ca²⁺ é responsável pela liberação de neurotransmissores atividade-dependente, pela regulação da motilidade citoesquelética, pelo ajuste fino dos processos metabólicos, bem como por muitos outros mecanismos necessários para a adequada manutenção e função neuronal ^1,2. Para garantir uma sinalização intracelular eficaz, os neurônios devem manter baixos níveis basais de Ca²⁺ em seu citoplasma³. Isso é realizado por mecanismos cooperativos de manipulação de Ca 2+, incluindo a captação de Ca²⁺ em organelas como o retículo endoplasmático (RE) e mitocôndrias. Esses processos, além do arranjo de canais iônicos permeáveis ao Ca 2+ na membrana plasmática, resultam em níveis heterogêneos de Ca²⁺ citoplasmático em todo o neurônio.

A heterogeneidade do Ca 2+ durante o repouso e a ativação neuronal permitem a regulação diversa e local-específica dos mecanismos dependentes do Ca ²⁺ 1. Um exemplo dos efeitos concentração-específicos do Ca 2+ é a liberação de Ca ²⁺ do RE através dos receptores inositol 1,4,5-trisfosfato (InsP 3). Baixos níveis de Ca²⁺ em combinação com InsP₃ são necessários para a abertura do poro permeável ao cálcio do receptor. Alternativamente, altos níveis de Ca²⁺ inibem direta e indiretamente o receptor⁴. A importância da homeostase do Ca 2+ para a função neuronal adequada é apoiada por evidências que sugerem que a interrupção da manipulação e sinalização intracelular do Ca²⁺ é um passo precoce na patogênese de doenças neurodegenerativas e envelhecimento natural ^5,6. Especificamente, a captação e liberação anormais de Ca²⁺ pelo PS e mitocôndrias estão ligadas ao aparecimento de disfunção neuronal na doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington ^6,7.

O estudo da dishomeostase de Ca 2+ durante o envelhecimento natural ou neurodegeneração requer a observação longitudinal dos níveis de Ca²⁺ com resolução subcelular em um organismo vivo e intacto, no qual a arquitetura celular nativa (isto é, o arranjo de sinapses e distribuição de canais iônicos) é mantida. Para este fim, este protocolo fornece orientação sobre o uso de dois sensores Ca²+ codificados geneticamente prontamente disponíveis para registro da dinâmica de Ca²⁺ in vivo com alta resolução espacial e temporal. Os resultados representativos obtidos usando o método descrito em C. elegans demonstram como a expressão de indicadores de Ca 2+ no citoplasma ou na matriz mitocondrial de neurônios individuais pode permitir a aquisição rápida de imagens fluorescentes (até 50 Hz) que ilustram a dinâmica do Ca 2+ com a capacidade adicional de discernir os níveis de Ca ²⁺ dentro de estruturas semelhantes à coluna vertebral e mitocôndrias individuais.

Protocol

1. Criação de cepas transgênicas Usando um método de clonagem de escolha8,9, clone vetores de expressão para conter o promotor Pflp-18 ou Prig-3 (para sinal AVA-específico no cordão nervoso ventral), seguido pelo indicador de escolha Ca2+ e, em seguida, um UTR 3′ (veja a discussão para obter mais informações)10. Uma lista de plasmídeos e suas fontes pode ser encontrada na <…

Representative Results

Estes dois protocolos permitem a rápida aquisição de níveis diferenciais de Ca2+ dentro das regiões subcelulares e organelas de neuritos individuais in vivo com alta resolução espacial. O primeiro protocolo permite a dosagem citoplasmática de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial. Isso é demonstrado aqui usando a expressão célula-específica de GCaMP6f nos interneurônios de comando glutamatérgico AVA15, cujos neuritos percorrem toda a extensão d…

Discussion

A primeira consideração ao implementar o método descrito envolve a seleção de um indicador Ca²⁺ com características ideais para a pergunta de pesquisa dada. Os indicadores citoplasmáticos de Ca 2+ tipicamente têm alta afinidade por Ca 2+, e a sensibilidade desses indicadores ao Ca²⁺ está inversamente relacionada à cinética (taxa liga/desliga)^16,17. Isso significa que a sensibilidade ou a cinética do Ca^2…

Materials

100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2