Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Summary

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l’imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Abstract

L’imaging del calcio (Ca 2+) è stato ampiamente utilizzato per esaminare l’attività neuronale, ma sta diventando sempre più chiaro che la manipolazione subcellulare di Ca²⁺ è una componente cruciale della segnalazione intracellulare. La visualizzazione della dinamica subcellulare di Ca²⁺ in vivo, dove i neuroni possono essere studiati nei loro circuiti nativi e intatti, si è dimostrata tecnicamente impegnativa nei sistemi nervosi complessi. La trasparenza e il sistema nervoso relativamente semplice del nematode Caenorhabditis elegans consentono l’espressione cellula-specifica e la visualizzazione in vivo di tag e indicatori fluorescenti. Tra questi ci sono indicatori fluorescenti che sono stati modificati per l’uso nel citoplasma e vari compartimenti subcellulari, come i mitocondri. Questo protocollo consente l’imaging non raziometrico di Ca 2+ in vivo con una risoluzione subcellulare che consente l’analisi della dinamica di Ca²⁺ fino al livello delle singole spine dendritiche e dei mitocondri. Qui, due indicatori geneticamente codificati disponibili con diverse affinità Ca 2+ sono utilizzati per dimostrare l’uso di questo protocollo per misurare i livelli relativi di Ca²⁺ all’interno del citoplasma o della matrice mitocondriale in una singola coppia di interneuroni eccitatori (AVA). Insieme alle manipolazioni genetiche e alle osservazioni longitudinali possibili in C. elegans, questo protocollo di imaging può essere utile per rispondere a domande su come la manipolazione di Ca²⁺ regola la funzione neuronale e la plasticità.

Introduction

Gli ioni calcio (Ca²⁺) sono vettori altamente versatili di informazioni in molti tipi di cellule. Nei neuroni, Ca²⁺ è responsabile del rilascio dipendente dall’attività dei neurotrasmettitori, della regolazione della motilità citoscheletrica, della messa a punto dei processi metabolici, nonché di molti altri meccanismi necessari per il corretto mantenimento e funzione neuronale ^1,2. Per garantire un’efficace segnalazione intracellulare, i neuroni devono mantenere bassi i livelli basali di Ca²⁺ nel loro citoplasma³. Ciò è ottenuto da meccanismi di manipolazione cooperativa di Ca 2+, incluso l’assorbimento di Ca²⁺ in organelli come il reticolo endoplasmatico (ER) e i mitocondri. Questi processi, oltre alla disposizione dei canali ionici permeabili al Ca 2+ nella membrana plasmatica, determinano livelli eterogenei di Ca²⁺ citoplasmatico in tutto il neurone.

L’eterogeneità di Ca 2+ durante il riposo e l’attivazione neuronale consente la regolazione diversificata e specifica della posizione dei meccanismi dipendenti da Ca^{2+ 1}. Un esempio degli effetti specifici della concentrazione di Ca 2+ è il rilascio di Ca²⁺ dall’ER attraverso i recettori dell’inositolo 1,4,5-trisfosfato (InsP₃). Bassi livelli di Ca²⁺ in combinazione con InsP₃ sono necessari per l’apertura del poro permeabile al calcio del recettore. In alternativa, alti livelli di Ca²⁺ inibiscono direttamente e indirettamente il recettore⁴. L’importanza dell’omeostasi del Ca 2+ per la corretta funzione neuronale è supportata da prove che suggeriscono che la manipolazione e la segnalazione intracellulare di Ca²⁺ è un passo iniziale nella patogenesi dei disturbi neurodegenerativi e dell’invecchiamento naturale ^5,6. In particolare, l’assorbimento e il rilascio anormali di Ca²⁺ da parte dell’ER e dei mitocondri sono legati all’insorgenza di disfunzioni neuronali nella malattia di Alzheimer, nel morbo di Parkinson e nella malattia di Huntington ^6,7.

Lo studio della disomeostasi di Ca 2+ durante l’invecchiamento naturale o la neurodegenerazione richiede l’osservazione longitudinale dei livelli di Ca²⁺ con risoluzione subcellulare in un organismo vivente e intatto in cui viene mantenuta l’architettura cellulare nativa (cioè la disposizione delle sinapsi e la distribuzione dei canali ionici). A tal fine, questo protocollo fornisce indicazioni sull’uso di due sensori Ca 2+ codificati geneticamente disponibili per la registrazione delle dinamiche Ca²⁺ in vivo con elevata risoluzione spaziale e temporale. I risultati rappresentativi acquisiti utilizzando il metodo descritto in C. elegans dimostrano come l’espressione di indicatori di Ca 2+ nel citoplasma o nella matrice mitocondriale di singoli neuroni possa consentire la rapida acquisizione di immagini fluorescenti (fino a 50 Hz) che illustrano la dinamica di Ca 2+ con la capacità aggiuntiva di discernere i livelli di Ca ²⁺ all’interno di singole strutture simili a spine e singoli mitocondri.

Protocol

1. Creazione di ceppi transgenici Utilizzando un metodo di clonazione a scelta8,9, clonare vettori di espressione per contenere il promotore Pflp-18 o Prig-3 (per il segnale specifico AVA nel cordone nervoso ventrale), seguito dall’indicatore di scelta Ca2+, e quindi un 3′ UTR (vedere la discussione per maggiori informazioni)10. Un elenco dei plasmidi e delle loro fonti può essere tr…

Representative Results

Questi due protocolli consentono la rapida acquisizione di livelli differenziali di Ca2+ all’interno delle regioni subcellulari e degli organelli dei singoli neuriti in vivo con elevata risoluzione spaziale. Il primo protocollo consente la misurazione del Ca 2+ citoplasmatico con elevata risoluzione temporale e spaziale. Ciò è dimostrato qui utilizzando l’espressione cellula-specifica di GCaMP6f negli interneuroni15 del comando glutammatergico AVA, i cui neuriti pe…

Discussion

La prima considerazione quando si implementa il metodo descritto comporta la selezione di un indicatore Ca²⁺ con caratteristiche ideali per la domanda di ricerca data. Gli indicatori citoplasmatici di Ca 2+ hanno tipicamente un’alta affinità per Ca 2+ e la sensibilità di questi indicatori a Ca ²⁺ è inversamente correlata alla cinetica (on/off rate)^16,17. Ciò significa che la sensibilità o la cinetica di Ca^2+</…

Materials

100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2