הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo
Summary
השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.
Abstract
הדמיית סידן (Ca 2+) שימשה בעיקר לבחינת הפעילות העצבית, אך מתברר יותר ויותר כי טיפול תת-תאי ב- Ca2+ הוא מרכיב חיוני באיתות תוך תאי. ההדמיה של דינמיקת Ca2+ de vivo תת-תאית, שבה ניתן לחקור נוירונים במעגלים הטבעיים והשלמים שלהם, הוכחה כמאתגרת מבחינה טכנית במערכות עצבים מורכבות. השקיפות ומערכת העצבים הפשוטה יחסית של הנמטודה Caenorhabditis elegans מאפשרות ביטוי ספציפי לתא והדמיה in vivo של תגים ואינדיקטורים פלואורסצנטיים. בין אלה הם אינדיקטורים פלואורסצנטיים שהותאמו לשימוש בציטופלסמה, כמו גם תאים תת-תאיים שונים, כגון המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה לא רציומטרית של Ca 2+ in vivo עם רזולוציה תת-תאית המאפשרת ניתוח של דינמיקת Ca2+ עד לרמת עמוד השדרה הדנדריטי והמיטוכונדריה הבודדים. כאן, שני אינדיקטורים מקודדים גנטית זמינים עם זיקות Ca 2+ שונות משמשים כדי להדגים את השימוש בפרוטוקול זה למדידת רמות Ca2+ יחסיות בתוך הציטופלסמה או המטריצה המיטוכונדריאלית בזוג יחיד של נוירונים מעוררים (AVA). יחד עם המניפולציות הגנטיות ותצפיות האורך האפשריות ב– C. elegans, פרוטוקול הדמיה זה עשוי להיות שימושי לענות על שאלות לגבי האופן שבו טיפול Ca2+ מווסת את התפקוד העצבי ואת הפלסטיות.
Introduction
יוני סידן (Ca2+) הם נשאים רב-תכליתיים ביותר של מידע בסוגי תאים רבים. בנוירונים, Ca2+ אחראי על שחרור תלוי פעילות של מוליכים עצביים, ויסות תנועתיות השלד הציטו-שלד, כוונון עדין של תהליכים מטבוליים, כמו גם מנגנונים רבים אחרים הדרושים לתחזוקה עצבית נאותה ותפקוד 1,2. כדי להבטיח איתות תוך-תאי יעיל, תאי עצב חייבים לשמור על רמות נמוכות של Ca2+ בסיסי בציטופלסמה3 שלהם. זה מושג על ידי מנגנוני טיפול Ca 2+ שיתופיים, כולל ספיגה של Ca2+ לתוך אברונים כגון הרשתית האנדופלסמית (ER) והמיטוכונדריה. תהליכים אלה, בנוסף לסידור של תעלות יונים חדירות Ca 2+ בקרום הפלזמה, גורמים לרמות הטרוגניות של Ca2+ ציטופלזמי בכל תא העצב.
הטרוגניות Ca 2+ במהלך מנוחה והפעלה עצבית מאפשרת ויסות מגוון וספציפי למיקום של מנגנונים תלויי Ca2+ 1. דוגמה אחת להשפעות הספציפיות לריכוז של Ca 2+ היא שחרור Ca2+ מהמיון דרך קולטני אינוסיטול 1,4,5-trisphosphate (InsP3). רמות נמוכות של Ca2+ בשילוב עם InsP3 נדרשות לפתיחת נקבובית הסידן החדירה של הקולטן. לחלופין, רמות גבוהות של Ca2+ מעכבות באופן ישיר ועקיף את הקולטן4. החשיבות של Ca 2+ הומאוסטזיס לתפקוד עצבי תקין נתמכת על ידי ראיות המצביעות על כך שטיפול ואיתות תוך תאי Ca2+ משובש הוא צעד מוקדם בפתוגנזה של הפרעות נוירודגנרטיביות והזדקנות טבעית 5,6. באופן ספציפי, ספיגה חריגה של Ca2+ ושחרור על ידי המיון והמיטוכונדריה קשורים להופעת תפקוד עצבי לקוי במחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת הנטינגטון 6,7.
המחקר של Ca 2+ dyshomeostasis במהלך הזדקנות טבעית או ניוון עצבי דורש תצפית אורכית של רמות Ca2+ עם רזולוציה תת-תאית באורגניזם חי ושלם שבו נשמרת הארכיטקטורה התאית הטבעית (כלומר, סידור הסינפסות ופיזור תעלות היונים). לשם כך, פרוטוקול זה מספק הנחיות לשימוש בשני חיישני Ca 2+ זמינים ומקודדים גנטית להקלטת דינמיקת Ca2+ in vivo ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה. התוצאות המייצגות שהתקבלו בשיטה המתוארת ב- C. elegans מדגימות כיצד ביטוי של אינדיקטורים Ca 2+ בציטופלסמה או במטריצה המיטוכונדריאלית של נוירונים בודדים יכול לאפשר רכישה מהירה של תמונות פלואורסצנטיות (עד 50 הרץ) הממחישות את הדינמיקה של Ca 2+ עם יכולת נוספת להבחין ברמות Ca 2+ בתוך מבנים דמויי עמוד שדרה יחיד ומיטוכונדריה בודדת.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיקול הראשון ביישום השיטה המתוארת כרוך בבחירת אינדיקטור Ca2+ עם מאפיינים אידיאליים לשאלת המחקר הנתונה. לאינדיקטורים ציטופלזמיים Ca 2+ יש בדרך כלל זיקה גבוהה ל- Ca 2+, והרגישות של אינדיקטורים אלה ל- Ca 2+ קשורה ביחס הפוך לקינטיקה (קצב הפעלה/כיבוי)16,17<sup class…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) (R01- NS115947 הוענק F. Hoerndli). ברצוננו להודות גם לד”ר אטילה סטק על פלסמיד pAS1.
Materials
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
Referências
- Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21 (1), 13-26 (1998).
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: Function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
- Brini, M., Calì, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Intracellular calcium homeostasis and signaling. Metal Ions in Life Sciences. 12, 119-168 (2013).
- Berridge, M. J. The inositol trisphosphate/calcium signaling pathway in health and disease. Physiological Reviews. 96 (4), 1261-1296 (2016).
- Schrank, S., Barrington, N., Stutzmann, G. E. Calcium-handling defects and neurodegenerative disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (7), 035212 (2020).
- Pchitskaya, E., Popugaeva, E., Bezprozvanny, I. Calcium signaling and molecular mechanisms underlying neurodegenerative diseases. Cell Calcium. 70, 87-94 (2018).
- Jadiya, P., et al. Impaired mitochondrial calcium efflux contributes to disease progression in models of Alzheimer’s disease. Nature Communications. 10 (1), 3885 (2019).
- Zeiser, E., Frøkjær-Jensen, C., Jorgensen, E., Ahringer, J. MosSCI and gateway compatible plasmid toolkit for constitutive and inducible expression of transgenes in the C. elegans germline. PLoS One. 6 (5), 20082 (2011).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-FusionTM assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
- Evans, T. C. Transformation and Microinjection. WormBook. , (2006).
- Giordano-Santini, R., Dupuy, D. Selectable genetic markers for nematode transgenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (11), 1917-1927 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans: Transferring worms grown on NGM plates. WormBook. , (2006).
- Ogama, T. A beginner’s guide to improving image acquisition in fluorescence microscopy. The Biochemist. 42 (6), 22-27 (2020).
- Mellem, J. E., Brockie, P. J., Madsen, D. M., Maricq, A. v. Action potentials contribute to neuronal signaling in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 865-867 (2009).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. bioRxiv. , (2021).
- Kerruth, S., Coates, C., Dürst, C. D., Oertner, T. G., Török, K. The kinetic mechanisms of fast-decay red-fluorescent genetically encoded calcium indicators. Journal of Biological Chemistry. 294 (11), 3934-3946 (2019).
- de Juan-Sanz, J., et al. Axonal endoplasmic reticulum Ca2+ content controls release probability in CNS nerve terminals. Neuron. 93 (4), 867-881 (2017).
- Fung, W., Wexler, L., Heiman, M. G. Cell-type-specific promoters for C. elegans glia. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 335-346 (2020).
- Ali, F., Kwan, A. C. Interpreting in vivo calcium signals from neuronal cell bodies, axons, and dendrites: a review. Neurophotonics. 7 (1), 011402 (2019).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Birkner, A., Tischbirek, C. H., Konnerth, A. Improved deep two-photon calcium imaging in vivo. Cell Calcium. 64, 29-35 (2017).
- Ryan, K. C., Laboy, J. T., Norman, K. R. Deregulation of mitochondrial calcium handling due to presenilin loss disrupts redox homeostasis and promotes neuronal dysfunction. Antioxidants. 11 (9), 1642 (2022).
- Yang, H. H., et al. Subcellular imaging of voltage and calcium signals reveals neural processing in vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Takahashi, N., Oertner, T. G., Hegemann, P., Larkum, M. E. Active cortical dendrites modulate perception. Science. 354 (6319), 1587-1590 (2016).
- Nicoletti, M., et al. Biophysical modeling of C. elegans neurons: Single ion currents and whole-cell dynamics of AWCon and RMD. PLoS One. 14 (7), 0218738 (2019).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L-type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496, 59-68 (1996).
- O’Hare, J. K., et al. Compartment-specific tuning of dendritic feature selectivity by intracellular Ca 2+ release. Science. 375 (6586), (2022).
- Mclntire, S. L., Jorgensen, E., Horvitz, H. R. Genes required for GABA function in Caenorhabditis elegans. Nature. 364 (6435), 334-337 (1993).
- Doser, R. L., Amberg, G. C., Hoerndli, F. J. Reactive oxygen species modulate activity-dependent AMPA receptor transport in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 40 (39), 7405-7420 (2020).
- Wu, J., et al. A long Stokes shift red fluorescent Ca2+ indicator protein for two-photon and ratiometric imaging. Nature Communications. 5, 5262 (2014).
- Cho, J. -. H., et al. The GCaMP-R family of genetically encoded ratiometric calcium indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).
- Smith, J. J., et al. A light sheet fluorescence microscopy protocol for Caenorhabditis elegans larvae and adults. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1012820 (2022).
- Müller, M., et al. Mitochondria and calcium regulation as basis of neurodegeneration associated with aging. Frontiers in Neuroscience. 12, 470 (2018).
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Calcium homeostasis in aging neurons. Frontiers in Genetics. 3, 200 (2012).
- Chen, C. -. H., Chen, Y. -. C., Jiang, H. -. C., Chen, C. -. K., Pan, C. -. L. Neuronal aging: Learning from C. elegans. Journal of Molecular Signaling. 8 (1), 14 (2013).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Sridhar, N., Fajrial, A. K., Doser, R. L., Hoerndli, F. J., Ding, X. Surface acoustic wave microfluidics for repetitive and reversible temporary immobilization of C. elegans. Lab on a Chip. 22 (24), 4882-4893 (2022).
