Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Summary

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo pt Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Abstract

Las imágenes de calcio (Ca 2+) se han utilizado en gran medida para examinar la actividad neuronal, pero cada vez está más claro que el manejo subcelular de Ca²⁺ es un componente crucial de la señalización intracelular. La visualización de la dinámica subcelular de Ca²⁺ in vivo, donde las neuronas pueden estudiarse en sus circuitos nativos e intactos, ha demostrado ser técnicamente desafiante en sistemas nerviosos complejos. La transparencia y el sistema nervioso relativamente simple del nematodo Caenorhabditis elegans permiten la expresión específica de la célula y la visualización in vivo de etiquetas e indicadores fluorescentes. Entre estos se encuentran indicadores fluorescentes que han sido modificados para su uso en el citoplasma, así como varios compartimentos subcelulares, como las mitocondrias. Este protocolo permite obtener imágenes no ratiométricas de Ca 2+ in vivo con una resolución subcelular que permite el análisis de la dinámica de Ca²⁺ hasta el nivel de las espinas dendríticas individuales y las mitocondrias. Aquí, se utilizan dos indicadores codificados genéticamente disponibles con diferentes afinidades de Ca 2+ para demostrar el uso de este protocolo para medir los niveles relativos de Ca²⁺ dentro del citoplasma o la matriz mitocondrial en un solo par de interneuronas excitatorias (AVA). Junto con las manipulaciones genéticas y las observaciones longitudinales posibles en C. elegans, este protocolo de imagen puede ser útil para responder preguntas sobre cómo el manejo de Ca²⁺ regula la función neuronal y la plasticidad.

Introduction

Los iones de calcio (^Ca2+) son portadores altamente versátiles de información en muchos tipos de células. En las neuronas, el Ca²⁺ es responsable de la liberación dependiente de la actividad de los neurotransmisores, la regulación de la motilidad del citoesqueleto, el ajuste fino de los procesos metabólicos, así como muchos otros mecanismos necesarios para el mantenimiento y la función neuronal adecuados ^1,2. Para garantizar una señalización intracelular efectiva, las neuronas deben mantener bajos los niveles basales de Ca²⁺ en su citoplasma³. Esto se logra mediante mecanismos cooperativos de manejo de Ca 2+, incluida la absorción de Ca²⁺ en orgánulos como el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias. Estos procesos, además de la disposición de los canales iónicos permeables al Ca 2+ en la membrana plasmática, dan como resultado niveles heterogéneos de Ca²⁺ citoplasmático en toda la neurona.

La heterogeneidad de Ca 2+ durante el reposo y la activación neuronal permite la regulación diversa y específica de la ubicación de los mecanismos dependientes de Ca ²⁺ 1. Un ejemplo de los efectos específicos de la concentración de Ca 2+ es la liberación de Ca²⁺ del RE a través de los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (InsP 3). Se requieren niveles bajos de Ca²⁺ en combinación con InsP₃ para la apertura del poro permeable al calcio del receptor. Alternativamente, los niveles altos de Ca²⁺ inhiben directa e indirectamente el receptor⁴. La importancia de la homeostasis del Ca 2+ para la función neuronal adecuada está respaldada por la evidencia que sugiere que la manipulación y señalización intracelular del Ca²⁺ interrumpido es un paso temprano en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos y el envejecimiento natural ^5,6. Específicamente, la absorción y liberación anormal de Ca²⁺ por el RE y las mitocondrias están relacionadas con la aparición de disfunción neuronal en la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington ^6,7.

El estudio de la dishomeostasis de Ca 2+ durante el envejecimiento natural o la neurodegeneración requiere la observación longitudinal de los niveles de Ca²⁺ con resolución subcelular en un organismo vivo e intacto en el que se mantiene la arquitectura celular nativa (es decir, la disposición de las sinapsis y la distribución de los canales iónicos). Con este fin, este protocolo proporciona orientación sobre el uso de dos sensores de Ca 2+ codificados genéticamente fácilmente disponibles para registrar la dinámica de Ca²⁺ in vivo con alta resolución espacial y temporal. Los resultados representativos adquiridos utilizando el método descrito en C. elegans demuestran cómo la expresión de indicadores de Ca 2+ en el citoplasma o matriz mitocondrial de neuronas individuales puede permitir la adquisición rápida de imágenes fluorescentes (hasta 50 Hz) que ilustran la dinámica de Ca 2+ con la capacidad adicional de discernir los niveles de Ca ²⁺ dentro de estructuras individuales similares a espinas y mitocondrias individuales.

Protocol

1. Creación de cepas transgénicas Utilizando un método de clonación de la elección8,9, clonar vectores de expresión para contener el promotor Pflp-18 o Prig-3 (para señal específica de AVA en el cordón nervioso ventral), seguido del indicador de elección Ca2+, y luego un UTR 3′ (ver la discusión para más información)10. Una lista de plásmidos y sus fuentes se puede encon…

Representative Results

Estos dos protocolos permiten la adquisición rápida de niveles diferenciales de Ca2+ dentro de las regiones subcelulares y orgánulos de neuritas individuales in vivo con alta resolución espacial. El primer protocolo permite la medición de Ca2+ citoplasmático con alta resolución temporal y espacial. Esto se demuestra aquí utilizando la expresión celular específica de GCaMP6f en las interneuronas15 del comando AVA glutamatérgico, cuyas neuritas recorren toda…

Discussion

La primera consideración al implementar el método descrito implica la selección de un indicador Ca²⁺ con características ideales para la pregunta de investigación dada. Los indicadores citoplasmáticos de Ca 2+ suelen tener una alta afinidad por el Ca 2+, y la sensibilidad de estos indicadores al Ca²⁺ está inversamente relacionada con la cinética (tasa de encendido/apagado)^16,17. Esto significa que la sensibilida…

Materials

100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2