Estandarización de la transferencia a través de laboratorios entre citómetros de flujo para la detección de linfocitos en niños vacunados con encefalitis japonesa
Summary
En este estudio, se desarrolló un método para facilitar la transferencia de entornos experimentales y plantillas de análisis entre dos citómetros de flujo en dos laboratorios para la detección de linfocitos en niños vacunados con encefalitis japonesa. El método de estandarización para los experimentos del citómetro de flujo permitirá que los proyectos de investigación se lleven a cabo de manera efectiva en múltiples centros.
Abstract
Un número cada vez mayor de laboratorios necesita recopilar datos de múltiples citómetros de flujo, especialmente para proyectos de investigación realizados en múltiples centros. Los desafíos de usar dos citómetros de flujo en diferentes laboratorios incluyen la falta de materiales estandarizados, problemas de compatibilidad de software, inconsistencias en la configuración del instrumento y el uso de diferentes configuraciones para diferentes citómetros de flujo. Para establecer un experimento estandarizado de citometría de flujo para lograr la consistencia y comparabilidad de los resultados experimentales en múltiples centros, se estableció un método de estandarización rápido y factible para transferir parámetros a través de diferentes citómetros de flujo.
Los métodos desarrollados en este estudio permitieron la transferencia de configuraciones experimentales y plantillas de análisis entre dos citómetros de flujo en diferentes laboratorios para la detección de linfocitos en niños vacunados con encefalitis japonesa (JE). Se obtuvo una intensidad de fluorescencia consistente entre los dos citómetros utilizando perlas estándar de fluorescencia para establecer la configuración del citómetro. Se obtuvieron resultados comparables en dos laboratorios con diferentes tipos de instrumentos. Usando este método, podemos estandarizar el análisis para evaluar la función inmune de niños vacunados con JE en diferentes laboratorios con diferentes instrumentos, disminuir las diferencias en datos y resultados entre citómetros de flujo en múltiples centros y proporcionar un enfoque factible para la acreditación mutua de resultados de laboratorio. El método de estandarización de los experimentos con citómetros de flujo garantizará el desempeño efectivo de los proyectos de investigación en múltiples centros.
Introduction
La estandarización de la citometría de flujo es útil para la comparabilidad de los resultados obtenidos de diferentes citómetros en diferentes laboratorios y centros de estudio, y conduce al reconocimiento mutuo de los resultados para mejorar la eficiencia del trabajo. Un número cada vez mayor de escenarios requiere estandarización. Durante el proceso de desarrollo del fármaco, la estandarización de la citometría de flujo es importante, ya que un ensayo desarrollado y validado apoyará todo el proceso de desarrollo del fármaco desde el análisis preclínico hasta el clínico. Los métodos de citometría de flujo se transfieren con frecuencia entre la industria farmacéutica y los laboratorios colaboradores1. Además, es esencial obtener datos comparables de estudios clínicos multicéntricos. Por ejemplo, se desarrolló un flujo de trabajo de estandarización en el Proyecto de Investigación Clínica Multicéntrica de Enfermedades Autoinmunes Sistémicas para obtener datos comparables de la citometría de flujo multicéntrica2.
La estandarización de los métodos de citometría de flujo es un desafío. Los desafíos experimentados en los laboratorios se atribuyen a la falta de materiales estandarizados, problemas de compatibilidad de software, inconsistencias en la configuración del instrumento y el uso de diferentes configuraciones entre diferentes citómetros de flujo y estrategias de compuerta divergentes entre los centros 3,4. Por lo tanto, es importante realizar un análisis de brecha entre laboratorios. El acceso a la muestra, los sistemas de calidad, las calificaciones del personal y la configuración del instrumento deben revisarse para garantizar que se cumplan los requisitos.
En la actualidad, los niños vacunados con la vacuna contra la encefalitis japonesa (JE) tienen una incidencia significativamente reducida de JE5. El monitoreo de las células inmunitarias de la sangre periférica puede ayudar a comprender los cambios en la inmunidad adaptativa mediada por células después de la vacunación y la correlación entre los cambios en los subconjuntos de linfocitos de sangre periférica y los efectos de la vacunación. Debido a la estabilidad limitada de las muestras de sangre total, las evaluaciones de la eficacia de la vacuna a menudo se realizan en múltiples centros. Para este análisis, definimos las células T CD8+ o CD4+ naïve como CD27+ CD45RA+, las células T de memoria central (TCM) como CD27+ CD45RA-, las células T con memoria efectora (TEM) como CD27- CD45RA-, y las células T de memoria efectora diferenciadas terminalmente (TEMRA) como CD27– CD45RA+. Las células B CD19+ se pueden separar en poblaciones que expresan CD27 versus IgD 6,7, las células B naïve expresan células B de memoria CD27n (mBCs) pueden identificarse en base a la expresión de IgD6, y las células T reguladoras (Tregs) pueden identificarse como CD4+CD25++CD127bajo 8. Para establecer un experimento estandarizado de citometría de flujo para lograr la consistencia y comparabilidad de los resultados experimentales en múltiples centros, se estableció un método de estandarización rápido y factible para facilitar la transferencia de protocolos a través de diferentes citómetros de flujo para la detección de linfocitos en la sangre total de niños vacunados con JE. Seis niños sanos (2 años de edad) fueron reclutados del Hospital de Niños de Beijing, Universidad Médica Capital. Después de recibir una vacuna de refuerzo y cebador con una vacuna JE SA14-14-2 viva atenuada menos de 6 meses antes, se recolectaron muestras de sangre periférica de los voluntarios. Se obtuvieron datos altamente comparables de diferentes instrumentos siguiendo procedimientos estandarizados, lo cual es útil para evaluaciones multicéntricas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El inmunofenotipado de los subgrupos de linfocitos de sangre periférica puede ayudar a comprender los cambios en la inmunidad adaptativa mediada por células después de la vacunación en niños. En aplicaciones clínicas, ocurren situaciones inesperadas, como la falta de detección de muestras de manera oportuna o el reemplazo de un citómetro de flujo; Por lo tanto, se necesitan métodos estandarizados rápidos que faciliten las transferencias entre citómetros de flujo en diferentes laboratorios 9,10,11.<sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RW fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing, China (No. 7222059), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82002130), XZ fue apoyado por el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (No. 2019-I2M-5-026).
Materials
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
Referências
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- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
