تحرير قاعدة فعال بدون PAM لنمذجة الزرد للأمراض الوراثية البشرية باستخدام zSpRY-ABE8e
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحرير فعال لقاعدة الأدينين دون قيود PAM لبناء نموذج دقيق لمرض الزرد باستخدام zSpRY-ABE8e.
Abstract
زادت تقنية CRISPR / Cas9 من قيمة أسماك الزرد لنمذجة الأمراض الوراثية البشرية ، ودراسة التسبب في الأمراض ، وفحص الأدوية ، لكن قيود الشكل المجاور للفضاء الأولي (PAM) تشكل عقبة رئيسية أمام إنشاء نماذج حيوانية دقيقة للاضطرابات الوراثية البشرية الناجمة عن متغيرات النوكليوتيدات المفردة (SNVs). حتى الآن ، أظهرت بعض متغيرات SpCas9 ذات التوافق الواسع مع PAM كفاءة في الزرد. أتاح تطبيق محرر قاعدة الأدينين المحسن بوساطة SpRY (ABE) ، zSpRY-ABE8e ، و gRNA المعدل صناعيا في الزرد تحويل قاعدة الأدينين والجوانين بكفاءة دون قيود PAM. الموصوف هنا هو بروتوكول لتحرير قاعدة الأدينين بكفاءة دون قيود PAM في الزرد باستخدام zSpRY-ABE8e. عن طريق حقن خليط من zSpRY-ABE8e mRNA و gRNA المعدل صناعيا في أجنة الزرد ، تم بناء نموذج مرض الزرد مع طفرة دقيقة تحاكي موقعا مسببا للأمراض لعامل نضج الريبوسوم TSR2 (tsr2). توفر هذه الطريقة أداة قيمة لإنشاء نماذج دقيقة للأمراض لدراسة آليات المرض والعلاجات.
Introduction
المتغيرات أحادية النوكليوتيدات (SNVs) التي تسبب طفرات خاطئة أو هراء هي المصدر الأكثر شيوعا للطفرات في الجينوم البشري1. لتحديد ما إذا كان SNV معين مسببا للأمراض ، ولإلقاء الضوء على التسبب فيه ، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية دقيقة2. الزرد هي نماذج جيدة للأمراض البشرية ، وتظهر درجة عالية من التماثل الفسيولوجي والجيني مع البشر ، ودورة نمو قصيرة ، وقدرة إنجابية قوية ، وهو أمر مفيد للبحث في الخصائص والآليات المسببة للأمراض ، وكذلك فحص الأدوية3.
تم تطبيق نظام التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) / Cas9 على نطاق واسع في تحرير الجينوم لمختلف الأنواع ، بما في ذلك الزرد4. مع توجيه gRNA ، يمكن لنظام CRISPR / Cas9 توليد فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل (DSBs) في الموقع المستهدف ، والتي تسمح بعد ذلك باستبدال قاعدة واحدة من خلال إعادة تركيب الموقع المستهدف مع قوالب الحمض النووي للمتبرع عبر مسار الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). ومع ذلك ، فإن كفاءة طريقة استبدال القاعدة هذه منخفضة جدا حيث يتم تنفيذ عملية إصلاح الحمض النووي الخلوي بشكل أساسي من خلال مسار الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، والذي عادة ما يكون مصحوبا بطفرات الإدراج والحذف (indel)5. لحسن الحظ ، تعمل تقنية التحرير أحادية القاعدة المستندة إلى CRISPR / Cas9 على تخفيف هذه المشكلة بشكل كبير باستخدام برامج التحرير الأساسية ، والتي تتيح تحريرا أكثر كفاءة لقاعدة واحدة دون حث DSBs. تم تطوير فئتين رئيسيتين من المحررين الأساسيين ، محرري قاعدة الأدينين (ABEs) ومحرري قاعدة السيتوزين (CBEs) ، لتنفيذ تحرير استبدال القاعدة ل A · تي إلى ز· C و C · G إلى T · أ ، على التوالي6،7،8،9،10،11. تغطي هذه الأنواع الأربعة من بدائل القاعدة 30٪ من المتغيرات المسببة للأمراض البشرية12. تم الإبلاغ عن أن كلا الفئتين من المحررين الأساسيين ، بما في ذلك PmCDA1 ونظام BE و CBE4max و ABE7.10 و ABE8e ، يعملان في الزرد ، مع الإبلاغ عن BE4max و ABE8e بشكل خاص لتحقيق نشاط تحرير مرتفع 13،14،15،16،17،18،19.
تم تنفيذ بروتينات Cas9 من أنواع مختلفة ، بما في ذلك المكورات العنقودية الذهبية ، والمكورات العقدية المقيحة ، و S. canis ، في تحرير جينات الزرد ، مع استخدام العقدية المقيحة Cas9 (SpCas9) على نطاق واسع20،21،22،23. ومع ذلك ، يمكن ل SpCas9 التعرف فقط على المواقع المستهدفة ذات الشكل المجاور ل NGG protospacer (PAM) ، مما يحد من نطاقه القابل للتحرير ويمكن أن يؤدي إلى عدم العثور على تسلسل مناسب بالقرب من الموقع الممرض محل الاهتمام24. لتوسيع النطاق المستهدف ، تم تصميم مجموعة متنوعة من متغيرات SpCas9 للتعرف على PAMs المختلفة من خلال التطور الموجه والتصميم الموجه بالهيكل. ومع ذلك ، فإن القليل من المتغيرات فعالة في الحيوانات ، وخاصة في الزرد ، مما يحد من تطبيق الزرد في أبحاث الأمراض المرتبطة ب SNV25،26،27،28. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن نوعين مختلفين من SpCas9 و SpG و SpRY ، مع قيود PAM أقل صرامة (NGN ل SpG و NNN ل SpRY مع تفضيل أعلى ل NRN من NYN) لإظهار نشاط تحرير عالي في الخلايا البشرية والنباتات29،30،31،32. بعد ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن SpG و SpRY ، بالإضافة إلى عدد من محرري القاعدة بوساطة ، مثل CBEs بوساطة SpRY و ABEs بوساطة SpRY ، للعمل في الزرد ، مما سيعزز تطبيق نماذج الزرد في الدراسة الميكانيكية وفحص الأدوية للأمراض المرتبطة ب SNV18،33،34،35. علاوة على ذلك ، تم اقتراح i-Silence كاستراتيجية فعالة ودقيقة للضربة القاضية الجينية من خلال تحويل كودون البدء بوساطة ABE من ATG إلى GTG أو ACG36. يوفر الجمع بين استراتيجية i-Silence والمحرر الأساسي بوساطة SpRY zSpRY-ABE8e طريقة جديدة لنمذجة الأمراض18. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء تحرير الجينات باستخدام zSpRY-ABE8e في الزرد لبناء نموذج tsr2 (M1V) باستخدام استراتيجية i-Silence. تم تقييم وتحليل كفاءة التحرير والأنماط الظاهرية التي تظهر في نماذج الزرد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول بناء نموذج مرض الزرد باستخدام المحرر الأساسي zSpRY-ABE8e. بالمقارنة مع مسار HDR التقليدي لاستبدال القاعدة ، يمكن لهذا البروتوكول تحقيق تحرير أساسي أكثر كفاءة وتقليل حدوث indels. في الوقت نفسه ، يتضمن هذا البروتوكول تنفيذ استراتيجية الضربة القاضية الجينية i-Silence المقترحة مؤخرا في…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر باربرا جاربرز ، دكتوراه ، من Liwen Bianji (Edanz) لتحرير النص الإنجليزي لمسودة هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحث والتطوير في المنطقة الرئيسية لمقاطعة قوانغدونغ (2019B030335001) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFE0106700) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32070819 ، 31970782) ، وبرنامج صندوق البحوث في مختبر مقاطعة قوانغدونغ الرئيسي للبيولوجيا المسببة للأمراض وعلم الأوبئة للحيوانات الاقتصادية المائية (PBEA2020YB05).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
- Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
- Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017).
- Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
- Nishida, K., et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science. 353 (6305), (2016).
- Gaudelli, N. M., et al. Directed evolution of adenine base editors with increased activity and therapeutic application. Nature Biotechnology. 38 (7), 892-900 (2020).
- Liu, Z., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in rabbit. Nature Communications. 9, 2717 (2018).
- Levy, J. M., et al. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses. Nature Biomedical Engineering. 4 (1), 97-110 (2020).
- Liu, Z., et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nature Communications. 9, 2338 (2018).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of interpretations of clinically relevant variants. Nucleic Acids Research. 44, 862-868 (2016).
- Qin, W., et al. Precise A•T to G•C base editing in the zebrafish genome. BMC Biology. 16 (1), 139 (2018).
- Tanaka, S., et al. In vivo targeted single-nucleotide editing in zebrafish. Scientific Reports. 8, 11423 (2018).
- Carrington, B., Weinstein, R. N., Sood, R. BE4max and AncBE4max are efficient in germline conversion of C:G to T:A base pairs in zebrafish. Cells. 9 (7), 1690 (2020).
- Zhang, Y., et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 8, 118 (2017).
- Rosello, M., et al. Precise base editing for the in vivo study of developmental signaling and human pathologies in zebrafish. eLife. 10, 65552 (2021).
- Liang, F., et al. SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish. Nature Communications. 13, 3421 (2022).
- Qin, W., Lu, X., Lin, S. Programmable base editing in zebrafish using a modified CRISPR-Cas9 system. Methods. 150, 19-23 (2018).
- Feng, Y., et al. Expanding CRISPR/Cas9 genome editing capacity in zebrafish using SaCas9. G3. 6 (8), 2517-2521 (2016).
- Liu, Y., et al. Genome editing in zebrafish by ScCas9 recognizing NNG PAM. Cells. 10 (8), 2099 (2021).
- Kleinstiver, B. P., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 523 (7561), 481-485 (2015).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR toolbox in zebrafish for studying development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 13 (2019).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
- Endo, M., et al. Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM. Nature Plants. 5, 14-17 (2019).
- Li, J., et al. Plant genome editing using xCas9 with expanded PAM compatibility. Journal of Genetics and Genomics. 46 (5), 277-280 (2019).
- Ren, Q., et al. PAM-less plant genome editing using a CRISPR-SpRY toolbox. Nature Plants. 7, 25-33 (2021).
- Xu, Z., et al. SpRY greatly expands the genome editing scope in rice with highly flexible PAM recognition. Genome Biology. 22 (1), 6 (2021).
- Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. 368 (6488), 290-296 (2020).
- Li, J., et al. Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Molecular Plant. 14 (2), 352-360 (2021).
- Vicencio, J., et al. Genome editing in animals with minimal PAM CRISPR-Cas9 enzymes. Nature Communications. 13, 2601 (2022).
- Rosello, M., et al. Disease modeling by efficient genome editing using a near PAM-less base editor in vivo. Nature Communications. 13, 3435 (2022).
- Cornean, A., et al. Precise in vivo functional analysis of DNA variants with base editing using ACEofBASEs target prediction. eLife. 11, 72124 (2022).
- Wang, X., et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Molecular Therapy. 28 (2), 431-440 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Crossley, B. M., et al. Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).
- Kluesner, M. G., et al. EditR: A method to quantify base editing from Sanger sequencing. The CRISPR Journal. 1 (3), 239-250 (2018).
- Gripp, K. W., et al. Diamond-Blackfan anemia with mandibulofacial dystostosis is heterogeneous, including the novel DBA genes TSR2 and RPS28. American Journal of Medical Genetics Part A. 164 (9), 2240-2249 (2014).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- Fu, Y., Reyon, D., Joung, J. K. Targeted genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases and truncated guide RNAs. Methods in Enzymology. 546, 21-45 (2014).
