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Biology

zSpRY-ABE8e के साथ मानव आनुवंशिक रोग के ज़ेब्राफ़िश मॉडलिंग के लिए कुशल PAM-कम आधार संपादन

Published: February 17, 2023
doi:
10.3791/64977
, , , , ,
1Key Laboratory of Brain, Cognition and Education Science,Ministry of Education, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science,South China Normal University, 3Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Environmentally Friendly Aquaculture, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, School of Life Sciences,South China Normal University, 4Department of Pathology, Guangdong Provincial People’s Hospital,Guangdong Academy of Medical Sciences

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि जेडएसआरवाई-एबीई 8 ई का उपयोग करके एक सटीक जेब्राफिश रोग मॉडल बनाने के लिए पीएएम सीमा के बिना कुशल एडेनिन बेस संपादन कैसे करें।

Abstract

CRISPR / Cas9 तकनीक ने मानव आनुवंशिक रोगों के मॉडलिंग, रोग रोगजनन का अध्ययन करने और दवा स्क्रीनिंग के लिए ज़ेबराफ़िश के मूल्य में वृद्धि की है, लेकिन प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) सीमाएं एकल-न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट (एसएनवी) के कारण मानव आनुवंशिक विकारों के सटीक पशु मॉडल बनाने के लिए एक बड़ी बाधा हैं। अब तक, व्यापक पीएएम संगतता वाले कुछ स्पास 9 वेरिएंट ने जेब्राफिश में दक्षता दिखाई है। ज़ेब्राफ़िश में अनुकूलित एसपीआरवाई-मध्यस्थता एडेनिन बेस एडिटर (एबीई), जेडएसआरवाई-एबीई 8 ई और सिंथेटिक रूप से संशोधित जीआरएनए के आवेदन ने पीएएम प्रतिबंध के बिना कुशल एडेनिन-गुआनिन बेस रूपांतरण को सक्षम किया है। यहां वर्णित जेडएसआरवाई-एबीई 8 ई का उपयोग करके जेब्राफिश में पीएएम सीमा के बिना कुशल एडेनिन बेस संपादन के लिए एक प्रोटोकॉल है। ज़ेबराफिश भ्रूण में zSpRY-ABE8e एमआरएनए और कृत्रिम रूप से संशोधित जीआरएनए के मिश्रण को इंजेक्ट करके, एक जेब्राफिश रोग मॉडल का निर्माण एक सटीक उत्परिवर्तन के साथ किया गया था जिसने टीएसआर 2 राइबोसोम परिपक्वता कारक (टीएसआर 2) की एक रोगजनक साइट का अनुकरण किया था। यह विधि रोग तंत्र और उपचार का अध्ययन करने के लिए सटीक रोग मॉडल की स्थापना के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करती है।

Introduction

एकल-न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट (एसएनवी) जो गलत समझ या बकवास उत्परिवर्तन का कारण बनते हैं, मानव जीनोम1 में उत्परिवर्तन का सबसे आम स्रोत हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कोई विशेष एसएनवी रोगजनक है, और इसके रोगजनन पर प्रकाश डालने के लिए, सटीक पशु मॉडल की आवश्यकता होतीहै2. ज़ेबराफ़िश अच्छे मानव रोग मॉडल हैं, जो मनुष्यों के साथ उच्च स्तर की शारीरिक और आनुवंशिक होमोलॉजी, एक लघु विकास चक्र और मजबूत प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन करते हैं, जो रोगजनक विशेषताओं और तंत्र, साथ ही दवा स्क्रीनिंग3 में अनुसंधान के लिए फायदेमंद है।

जेब्राफिश4 सहित विभिन्न प्रजातियों के जीनोम संपादन में नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर)/सीएएस 9 सिस्टम को व्यापक रूप से लागू किया गया है। जीआरएनए मार्गदर्शन के साथ, सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्रणाली लक्ष्य स्थल पर डीएनए डबल-फंसे ब्रेक (डीएसबी) उत्पन्न कर सकती है, जो तब होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) मार्ग के माध्यम से दाता डीएनए टेम्पलेट्स के साथ लक्ष्य साइट के पुनर्संयोजन के माध्यम से एकल-आधार प्रतिस्थापन की अनुमति देती है। हालांकि, इस आधार प्रतिस्थापन विधि की दक्षता काफी कम है क्योंकि सेलुलर डीएनए मरम्मत प्रक्रिया मुख्य रूप से गैर-समरूप अंत-जुड़ने (एनएचईजे) मार्ग द्वारा की जाती है, जो आमतौर पर सम्मिलन और विलोपन (इंडेल) उत्परिवर्तन5 के साथ होती है। सौभाग्य से, CRISPR / Cas9-आधारित एकल-आधार संपादन तकनीक आधार संपादकों का उपयोग करके इस समस्या को काफी कम करती है, जो DSB को प्रेरित किए बिना अधिक कुशल एकल-आधार संपादन सक्षम करती है। आधार संपादकों के दो प्रमुख वर्ग, एडेनिन बेस एडिटर (एबीई) और साइटोसिन बेस एडिटर (सीबीई), ए के लिए आधार प्रतिस्थापन संपादन को लागू करने के लिए विकसित किए गए हैं। T से G · C और C.G से T · ए, क्रमशः 6,7,8,9,10,11। इन चार प्रकार के आधार प्रतिस्थापन मानव रोगजनक वेरिएंट12 के 30% को कवर करते हैं। आधार संपादकों के दोनों वर्ग, जिनमें PMCDA1, BE सिस्टम, CBE4max, ABE7.10, और ABE8e शामिल हैं, को जेब्राफिश में काम करने की सूचना मिली है, जिसमें BE4max और ABE8e विशेष रूप से उच्च संपादन गतिविधि 13,14,15,16,17,18,19 प्राप्त करने की सूचना दी गई है।

स्टेफिलोकोकस ऑरियस, स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस और एस कैनिस सहित विभिन्न प्रजातियों के कैस 9 प्रोटीन को जेब्राफिश जीन संपादन में लागू किया गया है, जिसमें स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस कैस 9 (स्पास 9) का सबसे व्यापक रूप से20,21,22,23 उपयोग किया जा रहा है। हालांकि, SpCas9 केवल एक NGG प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति (PAM) के साथ लक्ष्य साइटों को पहचान सकता है, जो इसकी संपादन योग्य सीमा को सीमित करता है और इसकेपरिणामस्वरूप रोगजनक साइट के पास कोई उपयुक्त अनुक्रम नहीं पाया जा सकता है। लक्ष्य सीमा का विस्तार करने के लिए, विभिन्न प्रकार के SpCas9 वेरिएंट को निर्देशित विकास और संरचना-निर्देशित डिजाइन के माध्यम से विभिन्न PAM को पहचानने के लिए इंजीनियर किया गया है। हालांकि, कुछ प्रकार जानवरों में प्रभावी हैं, विशेष रूप से ज़ेबराफ़िश में, जो एसएनवी से संबंधित रोग अनुसंधान25,26,27,28 में ज़ेबराफ़िश के आवेदन को सीमित करता है। हाल ही में, कम कड़े पीएएम प्रतिबंधों (एसपीजी के लिए एनजीएन और एनवाईएन की तुलना में एनआरएन के लिए उच्च वरीयता के साथ एसपीआरआई के लिए एनएनएन) के दो प्रकारों को मानव कोशिकाओं और पौधों 29,30,31,32 में उच्च संपादन गतिविधि प्रदर्शित करने की सूचना मिली है। इसके बाद, एसपीजी और एसपीआरवाई के साथ-साथ उनके कई मध्यस्थ आधार संपादकों, जैसे कि एसपीआरवाई-मध्यस्थता सीबीई और एसपीआरवाई-मध्यस्थता एबीई को भी जेब्राफिश में काम करने की सूचना मिली है, जो एसएनवी से संबंधित बीमारियों 18,33,34,35 के यांत्रिक अध्ययन और दवा स्क्रीनिंग में जेब्राफिश मॉडल के आवेदन को बढ़ाएगा।. इसके अलावा, आई-साइलेंस को एटीजी से जीटीजी या एसीजी36 में एबीई-मध्यस्थता स्टार्ट कोडन रूपांतरण के माध्यम से एक प्रभावी और सटीक जीन-नॉकआउट रणनीति के रूप में प्रस्तावित किया गया था। आई-साइलेंस रणनीति और एसपीआरवाई-मध्यस्थता आधार संपादक zSpRY-ABE8e का संयोजन रोग मॉडलिंग18 के लिए एक नई विधि प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि आई-साइलेंस रणनीति का उपयोग करके टीएसआर 2 (एम 1 वी) मॉडल बनाने के लिए ज़ेबराफिश में zSpRY-ABE8e का उपयोग करके जीन संपादन कैसे करें। जेब्राफिश मॉडल में दिखाई देने वाली संपादन दक्षता और फेनोटाइप का मूल्यांकन और विश्लेषण किया गया था।

Protocol

यह अध्ययन दक्षिण चीन सामान्य विश्वविद्यालय की देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के सख्त अनुपालन में आयोजित किया गया था। 1. कृत्रिम रूप से संशोधित जीआरएनए और जेडएसआरवाई-एबीई 8 ई एमआरए?…

Representative Results

टीएसआर 2 के उत्परिवर्तन से डायमंड ब्लैकफैन एनीमिया (डीबीए) 42 होने की सूचना मिली है। यहां, आई-साइलेंस रणनीति का उपयोग करके टीएसआर 2 (एम 1 वी) उत्परिवर्तन के साथ एक डीबीए जेब्राफिश मॉडल का निर?…

Discussion

यह प्रोटोकॉल बेस एडिटर zSpRY-ABE8e का उपयोग करके एक ज़ेबराफ़िश रोग मॉडल के निर्माण का वर्णन करता है। आधार प्रतिस्थापन के लिए पारंपरिक एचडीआर मार्ग की तुलना में, यह प्रोटोकॉल अधिक कुशल आधार संपादन प्राप्त कर ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम इस पांडुलिपि के मसौदे के अंग्रेजी पाठ को संपादित करने के लिए लिवेन बियांजी (एडांज) से बारबरा गार्बर्स, पीएचडी को धन्यवाद देते हैं। इस काम को गुआंग्डोंग प्रांत के की-एरिया रिसर्च एंड डेवलपमेंट प्रोग्राम (2019बी030335001), चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2019वाईएफई0106700), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32070819, 31970782), और जलीय आर्थिक जानवरों के लिए रोगजनक जीवविज्ञान और महामारी विज्ञान के गुआंग्डोंग प्रांतीय कुंजी प्रयोगशाला के अनुसंधान निधि कार्यक्रम (पीबीईए 2020वाईबी05) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Agarose Sigma-Aldrich A9539 1.5% Agarose used to make an injection plate
Borosilicate Glass Capillaries  Harvard Apparatus BS4 30-0016
Cell culture dishes  Falcon 351029
ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit Vazyme C115 Kit for Infusion clone 
Codon optimization service Sangon Biotech
Drummond Microcaps Drummond Microcaps P1299-1PAK Length:32 mm, capacity:0.5 μL
EasyEdit gRNA service GenScript
Fine Forceps Fine Scientific Instrument 11254-20 Used to break meedle
Flaming/Brown Micropipette Puller  Stutter Instrument P-97 Used to pull the glass capillaries
HotStart Taq PCR StarMix Genstar A033-101 Used for PCR reaction
Intelligent artificial climate box TENLIN PRX-1000A Used to culture zebrafish embryos
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0512 Used to fix zebrafish when photographing
Microloader pipette tips  Eppendorf 5242956003
mMACHINE kit 
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 Vazyme C214-01 Kit for site-directed mutagenesis
Pneumatic Microinjector ZGene Biotech ZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9 Addgene 46757
RNeasy FFPE kit  Qiagen 73504 Kit for RNA purification
Sanger Sequencing service Sangon Biotech
Sodium hydroxide, granular Sangon A100173-0500 NaOH used for genome extraction
Stereo Microscope Olympus  SZX10 Used for photograph of phenotype
SZ Series Zoom Stereo Microscope CNOPTEC SZ650
T3 mMESSAGE Ambion AM1348 Kit for in vitro transcription 
TIANprep Mini Plasmid Kit TIANGEN DP103-03 Kit for plasmid extraction kit
TIANquick Mini Purification Kit TIANGEN DP203-02 Kit for purification for linearized plasmid
Tricaine Sigma-Aldrich E10521 Used to anesthetize zebrafish
Tris (hydroxymethyl) aminomethane Sangon A600194-0500 Component of Tris·HCl used for genome extraction
XbaI New England Biolabs R0145S Restriction endonuclease used for plasmid linearization
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References

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Zheng, S., Liang, F., Zhang, Y., Fei, J., Qin, W., Liu, Y. Efficient PAM-Less Base Editing for Zebrafish Modeling of Human Genetic Disease with zSpRY-ABE8e. J. Vis. Exp. (192), e64977, doi:10.3791/64977 (2023).
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