Trombose Arterial Induzida por Cloreto Férrico e Coleta de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica 3D
Summary
O presente protocolo descreve como usar uma lesão mediada por FeCl3 para induzir trombose arterial e como coletar e preparar amostras de lesão arterial em vários estágios da trombose para análise por microscopia eletrônica.
Abstract
As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. A trombose aberrante é uma característica comum de condições sistêmicas, como diabetes e obesidade, e de doenças inflamatórias crônicas, como aterosclerose, câncer e doenças autoimunes. Na lesão vascular, geralmente o sistema de coagulação, as plaquetas e o endotélio atuam de forma orquestrada para evitar o sangramento, formando um coágulo no local da lesão. Anormalidades nesse processo levam a sangramento excessivo ou trombose descontrolada/atividade antitrombótica insuficiente, o que se traduz em oclusão do vaso e suas sequelas. O modelo de lesão carotídea induzida por FeCl3 é uma ferramenta valiosa para investigar como a trombose se inicia e progride in vivo. Esse modelo envolve dano endotelial/desnudamento e subsequente formação de coágulos no local lesado. Ele fornece um ensaio quantitativo altamente sensível para monitorar o dano vascular e a formação de coágulos em resposta a diferentes graus de dano vascular. Uma vez otimizada, esta técnica padrão pode ser usada para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à trombose, bem como as alterações ultraestruturais nas plaquetas em um trombo crescente. Este ensaio também é útil para estudar a eficácia de agentes antitrombóticos e antiplaquetários. Este artigo explica como iniciar e monitorar a trombose arterial induzida por FeCl3 e como coletar amostras para análise por microscopia eletrônica.
Introduction
A trombose é a formação de um coágulo sanguíneo que bloqueia parcial ou completamente um vaso sanguíneo, impedindo o fluxo natural do sangue. Isso leva a eventos cardiovasculares graves e fatais, como doença cardíaca isquêmica e acidentes vasculares cerebrais. As doenças cardiovasculares são a principal causa de morbidade e mortalidade, sendo responsáveis por uma em cada quatro mortes nomundo1,2,3. Embora a trombose se manifeste como um mau funcionamento do sistema vascular, pode ser resultado de uma infecção microbiana ou viral subjacente, distúrbio imunológico, malignidade ou condição metabólica. O fluxo sanguíneo é mantido pela complexa interação entre diversos componentes do sistema vascular, incluindo células endoteliais, hemácias/leucócitos, plaquetas e fatores de coagulação4. Na lesão vascular, as plaquetas interagem com proteínas adesivas na matriz subendotelial e liberam seu conteúdo granular, que recruta mais plaquetas5. Concomitantemente, a cascata de coagulação é ativada, levando à formação e deposição de fibrina. Em última análise, forma-se um coágulo contendo plaquetas e hemácias aprisionadas dentro de uma tela de fibrina6. Embora drogas antiplaquetárias e anticoagulantes estejam disponíveis para modular a trombose, o sangramento espúrio continua sendo uma grande preocupação com essas terapias, exigindo ajuste fino das dosagens e combinações dessas drogas. Assim, ainda é urgente a descoberta de novas drogas antitrombóticas7.
A trombose é estudada usando vários métodos para infligir lesão vascular: mecânica (ligadura do vaso), térmica (lesão a laser) e lesão química (aplicação de FeCl3/Rosa Bengala). A natureza da trombose varia dependendo da localização (arterial vs. venosa), método ou extensão da lesão. Dentre todos esses tipos, a lesão vascular induzida por FeCl3 é o método mais utilizado. Tem sido empregada em camundongos, ratos, coelhos, cobaias e cães 8,9,10,11,12. O método é relativamente simples, fácil de usar e, se os principais parâmetros forem padronizados, é sensível e reprodutível em vários sistemas vasculares (por exemplo, artérias [carótida e femoral], veias [jugular] e arteríolas [cremaster e mesentérica]) (Tabela Suplementar 1).
Este modelo também pode ser usado para aprofundar nossa compreensão da mecânica e morfologia da formação de coágulos. Esta técnica oferece exclusivamente a vantagem de parar a trombose em vários pontos de fluxo, para estudar os estágios intermediários do processo antes que ele se torne oclusivo. Avanços recentes na pesquisa da trombose têm utilizado esse modelo para focar a atenção em métodos não farmacológicos detrombólise13 ou na liberação não invasiva de agentes antitrombóticos e/ou fibrinolíticos14,15. Vários grupos têm demonstrado que, quando as membranas plaquetárias são revestidas com essas terapêuticas, os fármacos podem ser ativados por estimulação térmica para atingir coágulos16. As técnicas aqui descritas podem ser úteis para estudos como a validação de seus achados em nível plaquetário único. Neste manuscrito, o Protocolo 1 descreve o procedimento básico de lesão vascular mediada por FeCl3, enquanto o Protocolo 2 descreve o método de coleta e correção da amostra de lesão vascular para posterior análise por microscopia eletrônica.
Protocol
Representative Results
Discussion
A aplicação tópica de FeCl3 na vasculatura para induzir trombose é uma técnica amplamente utilizada e tem sido fundamental no estabelecimento de papéis para vários receptores plaquetários, vias de sinalização de ligantes e seus inibidores20,21,22,23. O mecanismo pelo qual a FeCl3 causa trombose é multifacetado; Anteriormente, o desnudamento endotelial era consid…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem aos membros do Whiteheart Laboratory por sua cuidadosa análise deste manuscrito. O trabalho foi apoiado por subsídios do NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 e HL150818), e um Prêmio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos para S.W.W., R01 HL 155519 para B.S., e concessão do programa intramuros NIBIB para R.D.L.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
Referências
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