Целью этого протокола является определение аутофагических уровней в раке поджелудочной железы и ацинарных клетках поджелудочной железы с помощью иммунофлуоресценции LC3 и количественного определения точек LC3.
Аутофагия представляет собой специализированный катаболический процесс, который избирательно разрушает цитоплазматические компоненты, включая белки и поврежденные органеллы. Аутофагия позволяет клеткам физиологически реагировать на стрессовые стимулы и, таким образом, поддерживать клеточный гомеостаз. Раковые клетки могут модулировать свои уровни аутофагии, чтобы адаптироваться к неблагоприятным условиям, таким как гипоксия, дефицит питательных веществ или повреждение, вызванное химиотерапией. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы является одним из самых смертоносных видов рака. Раковые клетки поджелудочной железы обладают высокой аутофагической активностью из-за транскрипционной апрегуляции и посттрансляционной активации белков аутофагии.
Здесь клеточная линия PANC-1 использовалась в качестве модели раковых клеток поджелудочной железы человека, а линия ацинарных клеток поджелудочной железы AR42J использовалась в качестве физиологической модели высокодифференцированных клеток млекопитающих. В этом исследовании в качестве индикатора состояния активации аутофагии использовали иммунофлуоресценцию связанного с микротрубочками белка легкой цепи 3 (LC3). LC3 представляет собой белок аутофагии, который в базальных условиях демонстрирует диффузный паттерн распределения в цитоплазме (известный как LC3-I в этом состоянии). Индукция аутофагии запускает конъюгацию LC3 с фосфатидилэтаноламином на поверхности новообразованных аутофагосом с образованием LC3-II, связанного с мембраной белка, который помогает в образовании и расширении аутофагосом. Для количественной оценки количества меченых автофагических структур было использовано программное обеспечение с открытым исходным кодом FIJI с помощью инструмента «3D Objects Counter».
Измерение аутофагических уровней как в физиологических условиях, так и в раковых клетках позволяет нам изучать модуляцию аутофагии при различных условиях, таких как гипоксия, химиотерапия или нокдаун определенных белков.
Макроаутофагия (обычно называемая аутофагией) представляет собой специализированный катаболический процесс, который избирательно разрушает цитоплазматические компоненты, включая белки и поврежденные органеллы 1,2. Аутофагия позволяет клеткам физиологически реагировать на стрессовые стимулы и, таким образом, поддерживать клеточный гомеостаз3. Во время аутофагии образуется пузырь с двойной мембраной: аутофагосома. Аутофагосома содержит молекулы груза и направляет их в лизосому для деградации 1,4.
Аутофагосомы украшены легкой цепью белка 3 (LC3)5, ассоциированной с аутофагическим белком, связанным с микротрубочками. Когда аутофагия не индуцирована, LC3 диффундирует в цитоплазме и ядре в конформации LC3-I. С другой стороны, когда индуцируется аутофагия, LC3 конъюгируется с фосфатидилэтаноламином в мембране аутофагических структур6. Эта новая конформация LC3 известна как LC3-II1. Конформационный сдвиг LC3 вызывает изменения в его клеточной локализации и миграции электрофореза в додецилсульфате натрия-полиакриламидном геле (SDS-PAGE), которые могут быть обнаружены такими методами, как иммунофлуоресценция и вестерн-блоттинг 5,7. Таким образом, конъюгация LC3 является ключевым событием в аутофагическом процессе, которое может быть использовано для измерения аутофагической активности.
Ацинарная клетка поджелудочной железы является высокодифференцированной клеткой, которая в здоровых условиях имеет низкий уровень аутофагии. Однако в различных физиологических условиях или при фармакологической стимуляции они могут активировать аутофагию. Следовательно, определение аутофагических уровней в этой клеточной линии полезно для изучения потенциальных прямых или косвенных эффектов различных фармакологических или биологических агентов на аутофагию 8,9.
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы является одним из самых смертоносных видов рака, учитывая его позднюю диагностику и высокую устойчивость к химиотерапии10. Раковые клетки поджелудочной железы обладают высокой аутофагической активностью из-за транскрипционной апрегуляции и посттрансляционной активации белков, связанных с аутофагией11. Раковые клетки поджелудочной железы могут корректировать свои уровни аутофагии в ответ на неблагоприятные условия, такие как гипоксия, лишение питательных веществ или повреждение, вызванное химиотерапией11. Следовательно, анализ уровней аутофагии в раковых клетках поджелудочной железы может помочь понять, как они адаптируются к различным средам, и оценить эффективность лечения, модулирующего аутофагию.
В этом исследовании показан метод проведения иммунофлуоресценции LC3 на двух различных клеточных моделях поджелудочной железы. Первая модель, клетки PANC-1, послужили моделью для аденокарциномы протоков поджелудочной железы. Эти клетки обрабатывали гемцитабином, химиотерапевтическим агентом, который, как было показано ранее, индуцирует аутофагию, особенно в раковых клетках поджелудочной железы, несущих онкогенный ген вируса саркомы крысы Кирстен (KRAS)12,13. Вторая модель, клетки AR42J, служила более физиологической моделью экзокринных клеток поджелудочной железы. Эти клетки дифференцировались с дексаметазоном, чтобы стать более похожими на ацинарные клетки поджелудочной железы14. В этих клетках аутофагия была фармакологически индуцирована с помощью PP242, который является мощным ингибитором mTOR15. В этом исследовании мы демонстрируем применимость протокола, описанного с двумя разными моделями поджелудочной железы, и его способность различать состояния низкой и высокой аутофагии.
Способ, описанный в этом протоколе, позволяет визуализировать эндогенное распределение LC3 в клетке и количественно определять аутофагические уровни в различных условиях. Другой аналогичный метод, используемый для анализа распределения LC3 и определения активации аутофагии, включает м…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами Университета Буэнос-Айреса (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), Национального совета по научным исследованиям и технологиям (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; и PUE 22920170100033) и Национального агентства по развитию науки и технологий (PICT 2019-01664).
10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
12 mm round coverslips | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
24 Well- Cell Culture Plate | Sorfa | 220300 | |
Absolute ethanol | Biopack | 2207.10.00 | |
Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
Confocal Laser Scanning Microscope | Zeiss | LSM 800 | |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | 62248 | |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
Fetal Bovine Serum | NATOCOR | Lintc-634 | |
Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
LC3B (D11) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 3868S | |
Methanol | Anedra | 6197 | |
Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
Trypsin EDTA | Gibco | 11570626 |