Monitoraggio della pexofagia mediata da Stub1

Summary

Questo protocollo fornisce istruzioni per l’attivazione e il monitoraggio della pesofagia mediata da Stub1 in cellule vive.

Abstract

Le cellule di mammifero possono trasformare i perossisomi attraverso la pesofagia mediata da Stub1. Il percorso consente potenzialmente il controllo cellulare della quantità e della qualità dei perossisomi. Durante questo processo, la proteina da shock termico 70 e l’ubiquitina E3 ligasi, Stub1, traslocano sui perossisomi per essere girati per iniziare la pexofagia. L’attività della ligasi Stub1 consente l’accumulo di ubiquitina e di altri moduli correlati all’autofagia su perossisomi mirati. L’elevazione dei livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS) all’interno del lume perossisomale può attivare la pesofagia mediata da Stub1. Si può, quindi, utilizzare la generazione di ROS assistita da coloranti per innescare e monitorare questo percorso. Questo articolo delinea le procedure per l’utilizzo di due classi di coloranti, proteine fluorescenti e fluorofori sintetici, per avviare la pesofagia all’interno di colture cellulari di mammifero. Questi protocolli basati sulla generazione di ROS assistiti da coloranti non solo possono essere utilizzati per colpire tutti i perossisomi all’interno di una popolazione cellulare a livello globale, ma possono anche consentire la manipolazione di singoli perossisomi all’interno di singole cellule. Descriviamo anche come la pexofagia mediata da Stub1 può essere seguita usando la microscopia a cellule vive.

Introduction

I perossisomi sono organelli legati a membrana singola presenti nella maggior parte delle cellule eucariotiche. I perossisomi sono un compartimento metabolico essenziale per effettuare la beta-ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga, il catabolismo delle purine e la sintesi dei fosfolipidi eterici e degli acidi biliari¹. L’acetil-CoA derivata dai perossisomi controlla l’omeostasi lipidica regolando la segnalazione centrale nel metabolismo². Pertanto, non sorprende che le funzioni perossisomiali compromesse siano implicite in varie malattie, tra cui disturbi neurodegenerativi, invecchiamento, tumori, obesità e diabete ^3,4,5. Un processo essenziale nel mantenimento del funzionamento perossisomale è la pesofagia. La pexofagia è un processo catabolico per il turnover selettivo dei perossisomi da parte dell’autofagia. Le cellule usano la pexofagia per aiutare a controllare la quantità e la qualità dei perossisomi, garantendo così una corretta funzione perossisomiale. Uno studio recente ha dimostrato che la perdita di perossisomi causata da mutazioni nei fattori di biogenesi perossisomale PEX1 1 e 6 deriva dalla pexofagia 6 non controllata^. In particolare, il 65% di tutti i pazienti con disturbo della biogenesi dei perossisomi (PBD) presenta carenze nel complesso perossisomale AAA ATPasi, composto da PEX1, PEX6 e PEX26 nelle cellule di mammifero⁷.

Un certo numero di metodi possono essere utilizzati per iniziare e studiare la pesofagia. Nel lievito, la pexofagia viene attivata quando i nutrienti forniti passano da fonti di carbonio dipendenti dai perossisomi a fonti di carbonio indipendenti dai perossisomi (per abbassare il numero di perossisomi cellulari)⁸. Ad esempio, il trasferimento di cellule di Pichia pastoris coltivate a metanolo dal mezzo di metanolo al mezzo di glucosio e al mezzo di etanolo induce micropexofagia e macropexofagia, rispettivamente ^8,9,10. La micropexofagia sequestra i perossisomi raggruppati per la degradazione rimodellando il vacuolo per formare membrane di sequestro vacuolare simili a coppe e una struttura simile a un coperchio chiamata apparato di membrana micropexofagico-specifico (MIPA). Nella macropexofagia, i singoli perossisomi sono inghiottiti da strutture a doppia membrana note come pexofagosomi, seguite dalla fusione con il vacuolo per la degradazione ^8,9,10. La fosforilazione dei recettori della pesofagia, come Atg36p in Saccharomyces cerevisiae e Atg30p in Pichia pastoris, è fondamentale per i recettori per reclutare il meccanismo di autofagia centrale e per facilitare il targeting perossisomale agli autofagosomi ^8,11.

Nelle cellule di mammifero, la pesofagia può essere indotta dall’ubiquitinazione. La marcatura delle proteine di membrana perossisomale PMP34 o PEX3 con ubiquitina sul lato citosolico induce la pesofagia¹². La sovraespressione di PEX3 induce l’ubiquitinazione dei perossisomi e l’eliminazione dei perossisomi da parte dei lisosomi¹³. Inoltre, la fusione di PEX5 con un EGFP C-terminale compromette l’esportazione di PEX5 monoubiquitinata e provoca la pesofagia¹⁴. D’altra parte, la pexofagia può anche essere innescata dal trattamento con H 2 O₂. I perossisomi producono specie reattive dell’ossigeno (ROS); nello specifico, l’enzima perossisomale Acox1, che catalizza la fase iniziale della beta-ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga (> 22 carbonio), produce non solo acetil-CoA ma anche ROS perossisomiali. In risposta ai livelli elevati di ROS sotto il trattamento conH 2 O₂, le cellule di mammifero attivano la pexofagia per ridurre la produzione di ROS e alleviare lo stress. È stato riportato che il trattamentocon H 2 O₂ guida il reclutamento di atassia-telangiectasia mutata (ATM) in perossisomi. ATM quindi fosforila PEX5 per promuovere il turnover perossisomale mediante la pesofagia¹⁵.

Poiché i perossisomi sono centri di generazione di ROS, sono anche soggetti a danni da ROS. Le lesioni perossisomiali indotte da ROS costringono le cellule ad attivare la pexofagia per avviare le vie di controllo della qualità dei perossisomi (rimozione del perossisoma danneggiato mediante autofagia). Qui, delineiamo un approccio per l’innesco on-demand di lesioni perossisomiali indotte da ROS. Il protocollo sfrutta la produzione di ROS attivati dalla luce all’interno degli organelli 16,17,18,19,20 (Figura 1). I perossisomi marcati con colorante sono illuminati, portando alla produzione di ROS all’interno del lume perossisomiale, che innesca specificamente la lesione perossisomiale. Utilizzando questo protocollo, è dimostrato che i perossisomi stressati da ROS vengono rimossi attraverso una via di degradazione ubiquitina-dipendente. I perossisomi stressati da ROS reclutano l’ubiquitina E3 ligasi Stub1 per consentire il loro inghiottimento in autofagosomi per la rimozione individuale mediante pexofagia¹⁶. Si può usare questo protocollo per confrontare il destino dei perossisomi feriti e sani all’interno della stessa cellula mediante microscopia time-lapse. Il metodo può anche essere utilizzato per danneggiare globalmente tutti i perossisomi (in tutte le cellule) su un piatto di coltura, consentendo l’analisi biochimica della via della pexofagia.

Protocol

1. Preparazione di cellule che esprimono proteine diKillerRed o automarcanti (SLP) nel lume dei perossisomi Seminare le cellule desiderate su piatti di coltura cellulare con fondo di vetro. Per l’esperimento qui, seminare 2 x 105 cellule umane SHSY5Y in 840 μL di terreno di coltura (DMEM / F-12 integrato con il 10% di siero bovino fetale e l’1% di penicillina / streptomicina) o 6 x 104 cellule NIH3T3 di topo in 840 μL di terreno di coltura (DMEM integrato con siero bovin…

Representative Results

Lo schema di induzione della pesofagia mediata da Stub1 mostrato qui sfrutta la generazione di ROS assistita da coloranti all’interno del lume del perossisoma. Questa operazione richiede intensità luminose minime. I perossisomi contenenti proteine fluorescenti o coloranti possono quindi essere illuminati utilizzando microscopi confocali a scansione laser standard. L’illuminazione focale porta alla produzione istantanea e localizzata di ROS all’interno dei singoli perossisomi, come indicato dal reporter fluorescente roGF…

Discussion

Questo protocollo spiega in dettaglio come innescare la pesofagia mediata da Stub1 all’interno delle colture cellulari elevando i livelli di ROS perossisomale con la luce. Poiché il protocollo si basa sulla generazione di ROS assistita da coloranti, è necessario garantire un’espressione sufficiente di diKillerRed-VKSKL o colorazione del ligando SLP marcato con colorante all’interno delle cellule di interesse. Dato che diversi tipi di cellule o cellule di diverso background genetico possono ospitare perossisomi con prop…

Materials

35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell	MatTek	P35G-1.5-20-C	20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)	Sigma Aldrich	A8056
bovine serum	ThermoFisher Scientific	16170060
Cell culture incubator	Nuaire	NU-4750
diKillerRed-PTS1	Academia Sinica		made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher Scientific	11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientific	11330032
EGFP-C1	Clontech	pEGFP-C1	The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70	Academia Sinica		Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3B	Addgene	11546
EGFP-p62	Academia Sinica		generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1	Academia Sinica		generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Ub	Addgene	11928
fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10437028
HaloTag TMR ligand	Promega	G8252
HaloTag-PTS1	Academia Sinica		PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Inverted Confocal Microscope	Olympus	FV3000RS	405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand	Promega	GA1120
LED	VitaStar	PAR64	80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668	transfection reagent
NIH3T3 cell	ATCC	CRL-1658	adherent
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	319850	reduced serum media
penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140
PMP34-TagBFP	Academia Sinica		PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1	Academia Sinica		generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cell	ATCC	CRL-2266	adherent