Automatiseret multimodal stimulering og samtidig neuronal optagelse fra flere små organismer

Summary

Vi præsenterer en metode til fleksibel kemisk og multimodal stimulering og registrering af samtidig neural aktivitet fra mange Caenorhabditis elegans orme. Denne metode bruger mikrofluidik, open source-hardware og software og overvåget automatiseret dataanalyse for at muliggøre måling af neuronale fænomener såsom tilpasning, tidsmæssig hæmning og stimuluskrydstale.

Abstract

Fluorescerende genetisk kodede calciumindikatorer har bidraget meget til vores forståelse af neurale dynamikker fra niveauet af individuelle neuroner til hele hjernekredsløb. Imidlertid kan neurale reaktioner variere på grund af tidligere erfaring, interne tilstande eller stokastiske faktorer, hvilket skaber behovet for metoder, der kan vurdere neurale funktioner på tværs af mange individer på én gang. Mens de fleste registreringsteknikker undersøger et enkelt dyr ad gangen, beskriver vi brugen af vidvinkelmikroskopi til at opskalere neuronale optagelser til snesevis af Caenorhabditis elegans eller andre organismer under millimeterskala på én gang. Open source hardware og software giver stor fleksibilitet i programmering af fuldautomatiske eksperimenter, der styrer intensiteten og timingen af forskellige stimulustyper, herunder kemiske, optiske, mekaniske, termiske og elektromagnetiske stimuli. Især giver mikrofluidiske strømningsanordninger præcis, gentagelig og kvantitativ kontrol af kemosensoriske stimuli med sub-sekund tidsopløsning. NeuroTrackers semiautomatiserede dataanalysepipeline udtrækker derefter individuelle og populationsdækkende neurale reaktioner for at afdække funktionelle ændringer i neural ophidselse og dynamik. Dette papir præsenterer eksempler på måling af neuronal tilpasning, tidsmæssig hæmning og stimulus krydstale. Disse teknikker øger præcisionen og repeterbarheden af stimulering, tillader udforskning af populationsvariabilitet og kan generaliseres til andre dynamiske fluorescerende signaler i små biosystemer fra celler og organoider til hele organismer og planter.

Introduction

Calciumbilleddannelsesteknikker har muliggjort ikke-invasiv registrering af in vivo neurale dynamikker i realtid ved hjælp af fluorescensmikroskopi og genetisk kodede calciumindikatorer udtrykt i målceller ^1,2,3. Disse sensorer bruger typisk et grønt fluorescerende protein (GFP), såsom GFP-calmodulin-M13-peptidfamilien (GCaMP), til at øge fluorescensintensiteten ved neuronal aktivering og forhøjede intracellulære calciumniveauer. Calciumbilleddannelse har været særlig kraftfuld i nematoden C. elegans til at undersøge, hvordan neuroner og neurale kredsløb fungerer i levende, opfører dyr 4,5,6,7,8,9,10, da deres gennemsigtige natur betyder, at der ikke kræves nogen kirurgisk proces for optisk adgang^, og cellespecifikke genpromotorer målretter ekspression til cellerne af interesse. Disse teknikker gør ofte brug af mikrofluidiske enheder, som giver præcist kontrollerede miljøer til at studere biologiske, kemiske og fysiske fænomener i en lille fysisk skala^11,12. Mikrofluidiske enheder bugner til måling af neural aktivitet, med nye designs, der løbende udvikles, og de fremstilles let i forskningslaboratoriet. Imidlertid fanger mange designs et enkelt dyr ad gangen, hvilket begrænser den eksperimentelle gennemstrømning ^7,9,13. Neurale reaktioner varierer ofte betydeligt på tværs af dyr på grund af forskelle i tidligere erfaring, interne tilstande som stress eller sult eller stokastiske faktorer såsom genekspressionsniveauer. Disse forskelle skaber et behov for metoder, der samtidig kan stimulere og observere mange dyr og udtrække information fra individer⁴.

Derudover bliver visse neuromodulerende fænomener kun tydelige under specifikke stimuleringsbetingelser, såsom tidsmæssig hæmning¹⁴, som refererer til den korte undertrykkelse af reaktioner, når stimulering sker hurtigt efter hinanden. Elektrofysiologiske systemer kan drive neural aktivitet over et bredt stimulusrum til dette formål og modulere for eksempel den elektriske pulsstrøm, spænding, frekvens, bølgeform, driftscyklus og timing af periodiske stimulustog. Indirekte stimulering ved hjælp af naturligt påviste stimuli eller optogenetiske systemer ville drage fordel af en lignende bredde af kontrolmekanismer. I øjeblikket præsenteres mange naturlige stimuli på en simpel "on-off" måde, såsom lugtpræsentation og fjernelse, ved hjælp af kommercielle systemer, der har været langsomme til at tilføje fleksibilitet. Imidlertid kan billige mikrocontrollere nu automatisere leveringen af flere typer stimuli på en måde, der kan tilpasses forskernes behov. Kombineret med mikrofluidik har disse systemer nået målet om øget eksperimentel gennemstrømning og fleksibilitet, hvilket gør det muligt at måle neurale reaktioner på en række præcise stimuli samtidigt i mange dyr ^4,6. Multimodal stimulering kan bruges til yderligere at forhøre neuronale kredsløb, såsom ved at overvåge ændringer i neural excitabilitet, når de konsekvent stimulerer før, under og efter en ortogonal forstyrrelse såsom lægemiddeleksponering⁴. Fordelene ved billige, åbne mikroskopisystemer er klare for at fremme videnskabelig forskning, men i praksis kan behovet for delsourcing, konstruktion og ydeevnevalidering hindre vedtagelsen af disse teknikker.

Denne protokol har til formål at afhjælpe nogle af disse tekniske udfordringer. Mens tidligere protokoller har fokuseret på brug af mikrofluidisk enhed og grundlæggende stimulering 9,15,17, beskriver vi her konstruktionen og brugen af et fleksibelt, automatiseret^, multimodalt stimulusleveringssystem til neural billeddannelse i C. elegans eller andre små organismer, der anvender tidligere beskrevne mikrofluidiske enheder⁴. Open source-systemet programmeres via simple tekstfiler til at definere eksperimenterne, og NeuroTracker-dataanalyseprogrammet udtrækker halvautomatisk de neurale aktivitetsdata fra mikroskopvideoerne. Vi demonstrerer dette system med eksempler på vurdering af tidsmæssig hæmning, disinhibering og stimulus krydstale ved hjælp af den kemosensoriske neuron AWA, som depolariserer som reaktion på forskellige madlugte eller som reaktion på lys, når de udtrykker optogenetiske lysfølsomme ionkanaler ^5,6.

Protocol

1. Neuralt billedbehandlingsudstyr

BEMÆRK: Se Lawler og Albrecht¹⁵ for detaljerede instruktioner om opbygning af billeddannelses- og stimuleringssystemet, som styrer mikroskopbelysningstiming, billedoptagelse og stimuluslevering (figur 1). En billig Arduino Nano-stimulusregulator aktiverer fluidventilerne gennem digitale signaler til en ventilregulator og styrer den optogenetiske belysning gennem analoge spændingssignaler til en LED-controller. Andre stimuli, såsom vibrationsmotorer og termiske varmeapparater, kan styres ved hjælp af digitale eller analoge signaler. Stimulusregulatoren synkroniserer stimulering og billedoptagelse via kamerasignaler, som specificeret af open source Micro-Manager-mikroskopstyringssoftwaren (μManager)¹⁶. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser, udstyr og organismer, der anvendes i denne protokol.

1. Opsæt det neurale billeddannelsesudstyr, herunder et epifluorescensmikroskop med GFP-optik, et sCMOS-kamera med et digitalt eksponeringsudgangssignal og en stimuluscontroller¹⁵.
2. Tilslut stimulusregulatoren til de ønskede systemer via digitale eller analoge signaler. For eksemplerne nedenfor anvendes følgende systemer:
   1. Brug en ventilregulator til kemisk stimulering. Tilslut ventilregulatoren til fluidmagnetventil eller klemmeventiler (figur 1)¹⁵.
   2. Brug en 615 nm rød LED og controller til optogenetisk stimulering, monteret over mikroskoptrinnet.
3. Opsæt computeren med mikroskopstyringssoftwaren, opret en konfigurationsforudindstilling med udstyrsindstillinger, og sørg for, at stimulusstyringen fungerer korrekt¹⁵.

2. Fremstilling af mikrofluidiske enheder

BEMÆRK: Se Lagoy et ^al.17 for detaljerede oplysninger om opnåelse eller fremstilling af masterformene og produktion, brug og rengøring af de mikrofluidiske enheder. Disse trin er opsummeret nedenfor.

1. Få eller fremstil en masterform ved hjælp af den medfølgende mikrofluidiske designfil (albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷. For unge voksne C. elegans skal du sikre dig, at kanalhøjden er 55-70 μm.
2. Kombiner PDMS-basen og hærdningsmidlet i et vægtforhold på 10:1, og bland grundigt med overførselspipetter.
3. Afgas i 30-60 min i en vakuumekssikkator, indtil boblerne forsvinder.
4. Anbring masterformen i en stor (150 mm diameter) petriskål, og hæld den afgassede PDMS op til en dybde på 4-5 mm (~ 100 g). Undersøg og fjern støv eller bobler med en overførselspipette.
5. Bages ved 65 °C på en plan ovnhylde i 3 timer til natten over.
6. Når den er hærdet, skal du bruge en skalpel til at skære PDMS fra formen og et lige barberblad til at adskille enhederne.
7. Stans indløbs- og udløbshuller med en 1 mm dermal stans, og rengør dem med dH2 O, ethanol og igen med dH₂O. Tør enheden i en luftstrøm (se figur 2A).
8. Rengør begge sider af PDMS-enheden med tape, fjern støv eller snavs.
9. Klargør glasglassene til at færdiggøre den mikrofluidiske anordning som beskrevet¹⁷. Bor indløbshuller i det øverste objektglas med en diamantbit, og gør bundobjektet vandfrit ved udsættelse for TFOCS-dampe eller ved at anvende vandafvisende glasbehandling (figur 2B).
10. Saml glas-PDMS-enhedens sandwich i en klemme (figur 2C).

3. Tilberedning af dyr

1. Få eller opret dyr med genetisk kodede calciumindikatorer udtrykt i neuroner af interesse.
   BEMÆRK: For eksempel linje NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) udtrykker GCaMP og den røde lysfølsomme kationkanal Chrimson i AWA sensorisk neuron par⁶. Begge transgener er integreret i genomet for stabil ekspression i hvert dyr.
2. En dag før forsøget anbringes mindst 20 L4 larvestadie C. elegans pr. forsøg på en agarplade med nematodevækstmedium (NGM), der er podet med en OP50 E. coli-græsplæne. Når den opretholdes ved 20 °C, synkroniserer dette vildtypedyrene på det unge voksenstadium den næste dag.
   BEMÆRK: For array-transgener skal du vælge dyr ved hjælp af et fluorescensstereoskop for at sikre transgenekspression i de valgte dyr.

4. Forberedelse af opløsning

1. Forbered 1x S Basalbuffer (100 mM NaCl og 0,05 M KPO₄, pH 6,0) fra en 10x stamopløsning.
2. Forbered 1 mM tetramisol buffer ved at fortynde 1 M lager i 1x S Basal. Brug denne paralytiske buffer til at forberede alle stimuli. Et eksperiment bruger typisk ca. 150 ml.
3. Der tilsættes 0,1-1 μg/ml fluorescein til "kontrol"-bufferbeholderne for at visualisere flowet.
4. Opret stimulusopløsninger ved seriel fortynding til den ønskede endelige koncentration. Opret for eksempel en 10-7 fortynding af diacetyltiltrækningsmiddel ved først at oprette en ^10-3 bestand.
   BEMÆRK: En lille mængde fluorescein (0,1-1 μg / ml) kan tilsættes til stimulus- eller bufferopløsningen for at verificere stimulustiming, men koncentrationen bør være minimal for at undgå artefakter i neural fluorescens.

5. Forberedelse af mikrofluidisk enhed

BEMÆRK: Se Reilly et ^al.9 for en videoprotokol, der viser reservoirgenerering, enhedsopsætning og lastning af dyrene. Se også Lagoy et ^al.17 for en skriftlig protokol med mange nyttige tips.

1. Forbered tre eller flere væskereservoirer. For hver skal du fastgøre en 30 ml eller 60 ml sprøjtebeholder, en 3 ml primingsprøjte og en nålestub til en trevejs Luer-ventil (figur 2D). Tilslut nålen til mikroboreslangen udstyret med et metalrør i enden. Mærk reservoirerne, monter dem på et stativ, der er fastgjort til et ringstativ, og fyld dem med den tilsvarende buffer eller stimulusvæsker (figur 2E).
2. Afgas den samlede mikrofluidiske enhed i en vakuumekssikkator i ~ 1 time.
3. Fyld og fjern luftboblerne fra reservoirslangen ved hjælp af primingsprøjten. Fyld udstrømningsslangen med buffer.
4. Fjern den mikrofluidiske enhed fra vakuumet, og indsæt hurtigt udløbsslangen og injicer væsken gennem enheden, indtil en dråbe kommer ud af et indløb.
5. Ved dette indløb skal du bruge en "drop-to-drop"-forbindelse¹⁷ til at indsætte det tilsvarende fluidiske indløbsrør (figur 2F). Sørg for, at der er væskedråber på både indløbsslangen og enhedens porthul for at undgå at indføre en boble.
6. Injicer mere væske fra udløbet, tilslut det næste indløbsrør, og gentag, indtil alle indløbene er fyldt. Indsæt en udfyldt blokeringsstift ved eventuelle ubrugte indløb og ormens indlæsningsport.
7. Start flow ved at åbne Luer-ventilerne for indløb og udløb. Undersøg enheden for lækager ved indløb og glasbase. Undersøg enheden for eventuelle bobler inden for flowkanalerne eller indløbene ved hjælp af mikroskopbilledoptagelsessoftwaren i live-tilstand.
   BEMÆRK: Hvis der er bobler til stede, skal du vente på, at de absorberes i PDMS-materialet.

6. Indlæsning af dyr

BEMÆRK: Se Lagoy et ^al.17.

1. Overfør unge voksne dyr til en ikke-sået NGM-agarplade ved hjælp af en trådtippet "pick".
2. Pladen oversvømmes med ca. 5 ml 1x S Basalbuffer, så dyrene svømmer.
3. Træk ormene ind i en påfyldningssprøjte (1 ml eller 3 ml sprøjte med påsat slange, der er fyldt med 1x S Basal).
   1. Brug et stereoskop til at flytte slangenden under væskeoverfladen med den ene hånd til hvert ønsket dyr og trække den ind i slangen ved hjælp af sprøjten, der holdes i den anden hånd.
   2. Træk kun ormene ind i slangen, ikke i sprøjten.
      BEMÆRK: Slangen rummer typisk kun ca. 100 μL. Dyrene kan udvises i et lokalt område og derefter trækkes tilbage i slangen med et lille volumen.
4. Luk udløbsledningen, fjern snekkens ilægningsstift, og tilslut ormesprøjten til enheden ved hjælp af en drop-to-drop-forbindelse.
5. Hæld forsigtigt dyrene ind i arenaen, etabler bufferstrømmen og lad op til 1 time immobilisere af tetramisol.
   BEMÆRK: I immobiliseringsperioden skal du sikre dig, at kun buffervæske kommer ind i arenaen. Stimulus- og kontrolreservoirerne kan slukkes i denne periode, men åbn dem og kontroller det korrekte flow, før du kører stimuleringsforsøgene.

7. Automatiseret stimulering og neuronal optagelse

1. Opret en stimulusdefinitionstekstfil kaldet "User Defined Acquisition Settings.txt" med en teksteditor (f.eks. Notesblok), der indeholder stimuleringsindstillingerne for den automatiserede billedoptagelse (se eksempler i figur 3). Indstillingerne er opdelt i to sektioner:
   1. Indstillinger for mikroskopopkøb: Definer eksperimenttypen (Single-Stimulus eller Multi-Pattern), eksponerings- og excitationstiming, forsøgsvarighed og intervaller, og gem mappe.
   2. Indstillinger for stimulering: Definer stimuluskontrolparametrene. En "stimuleringskommando" specificerer de handlinger, der forekommer ved bestemte videobilleder med syntaksen , hvor bogstavkoderne er A = ventil1, B = ventil2, C = ventil3, L = LED-lys; Derudover store bogstaver = til og små bogstaver = fra. LED-intensiteten indstilles med bogstavkoden "i" og en værdi på 0 (fra) til 255 (maksimal lysstyrke).
      BEMÆRK: LED-intensitetsværdien fra 0 til 255 indstiller den analoge udgangsspænding fra 0 V til 5 V. Den nuværende controller, der bruges her, har en lineær intensitetsskalering, og andre skal kalibreres med en lyseffektmåler.
      1. For et enkeltstimuluseksperiment med kun én gentagen stimuleringskommando skal du bruge formatet i figur 3A.
      2. For et Multi-Pattern-eksperiment med flere stimuleringskommandoer skal du bruge formatet i figur 3B. Medtag en "mønstersekvens" af cifre, der repræsenterer rækkefølgen af stimulusmønstrene. For hvert mønster skal du indtaste en stimuleringskommando på en separat linje.
         BEMÆRK: En pseudotilfældig sekvens eller m-sekvens kan være nyttig til at undersøge afhængighed af stimulushistorik.
2. Kør mikroskopstyringssoftwaren. Kontroller, at alle fluidiske indløb er åbne, strømmen er som ønsket inden for arenaen (se figur 2H), og neuronerne af interesse er i fokus inden for live-vinduet.
3. Luk live-vinduet, og kør scriptet "MultiPattern_RunScript.bsh" i softwaren.
   BEMÆRK: Det er nyttigt at køre et testforsøg uden dyr for at verificere korrekt flow og stimulering. Erstatning af en anden fluoresceinkoncentration for hver stimulusvæske kan hjælpe med at visualisere og dokumentere nye stimulusmønstre.
4. Efter eksperimentering adskilles den mikrofluidiske enhed, og alle overflader, slanger og reservoirer skylles med vand.
   BEMÆRK: Alle komponenter kan genbruges snesevis af gange, hvis de holdes rene. Sørg for, at reservoirer, slanger og mikrofluidiske enheder holdes våde eller helt tørrede i en luftstrøm for at undgå saltkrystallisering, som kan tilstoppe og er vanskelig at fjerne. Udstyret kan opbevares i ethanol for at sterilisere, men skal tørres helt, før det genbruges (>1 time ved 65 °C)¹⁷.

8. Dataanalyse ved hjælp af NeuroTracker

BEMÆRK: NeuroTracker 4,18,19 er et ImageJ / FIJI²⁰ software-plugin til sporing af fluorescensintensiteten af flere neuroner og dyr^, selv når de bevæger sig under forsøg. Dette plugin gemmer data som tekstfiler med hver neurons position og baggrundskorrigeret fluorescensintensitet (F). Fluorescensdataene normaliseres til baseline fluorescens (F 0), for eksempel gennemsnittet af flere sekunder før stimulering, som Δ F / F 0 = (F -F 0) / F ₀, som kan beregnes som gennemsnit på tværs af populationer.

1. Installer NeuroTracker-scripts som anvist (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
2. Kør NeuroTracker ved at klikke på Plugins | Sporing | NeuroTracker.
3. Vælg den mappe, der indeholder . TIF-videofiler, der skal spores, og vælg de ønskede indstillinger.
   BEMÆRK: Hvis kun et undersæt af videofilerne skal spores, skal du vælge det numeriske område for de filer, der skal analyseres ved prompten. Standardsporingsindstillinger er passende for ikke-bevægelige dyr med en opløsning på 250 pix/mm. Juster parametrene proportionalt for andre opløsninger. Se brugervejledning¹⁹ for yderligere oplysninger om indstillinger.
4. Indstil intensitetstærsklen, så neuronerne er synlige for udvælgelse (figur 4).
5. Åbn kontrolvinduerne Lysstyrke/kontrast (B/C) og Tærskelværdi ved hjælp af billedet | Juster menuen.
6. I B / C-vinduet skal du justere skyderne Minimum og Maksimum , indtil neuronerne tydeligt kan skelnes (figur 4A).
7. I vinduet Tærskel skal du markere Mørk baggrund og Nulstil ikke rækkevidde.
8. Skub rammeskyderen for at observere neuronbevægelsen og intensitetsændringerne, og noter eventuelle dyr, der skal udelukkes fra sporing, f.eks. på grund af overlapning med andre dyr.
9. Identificer neuronerne til sporing.
10. For hvert dyr skal du justere tærskelniveauet, så det røde tærskelområde over neuronen er synligt i hvert billede før, under og efter stimulering.
11. Klik på neuronen for at registrere dens position og tærskelniveau.
12. Gentag tærskeljusteringen og udvælgelsen for hvert dyr og neuron, der skal spores. Se figur 4C for et godt eksempel på tærskelniveau og figur 4D,E for eksempler over og under tærskel. Tidligere udvalgte neuroner er angivet med en lille boks.
13. Når alle neuronerne er valgt, skal du trykke på mellemrumstasten for at begynde at spore.
    BEMÆRK: For yderligere NeuroTracker-eksempler, se tidligere referencer ^4,19.
14. Overvåg sporingsprocessen for hvert dyr, og foretag eventuelle nødvendige korrektioner.
15. Hvis NeuroTracker holder pause, har den mistet neuronen. Klik igen på neuronen, juster tærskelniveauet efter behov.
16. Hvis integrationsboksen springer til et andet dyr eller en ikke-neuronal struktur i nærheden, skal du trykke på mellemrumstasten for at sætte den på pause, flytte skyderen tilbage til den første fejlagtige ramme og klikke på den korrekte neuronplacering igen.

9. Dataudforskning og visualisering

BEMÆRK: MATLAB-analysescriptet bruges til databehandling og visualisering og til at generere oversigts-PDF-filer for hver analyse.

1. Kør filen "NeuroTrackerSummary_pdf.m" i MATLAB, og vælg den mappe, der indeholder NeuroTracker-datatekstfilerne.
2. Vent på, at der produceres en oversigts-PDF, så du kan verificere sporingsprocessen (figur 5). Dyr identificeres ved et tal (figur 5A), og de neurale reaktioner fra hvert dyr og forsøg kan ses for at vurdere populationsvariabiliteten (figur 5B).
3. Brug funktionen "databrowse.m" til at udforske de neurale data, for eksempel gruppering efter forsøgsnummer (figur 5C), efter dyrenummer (figur 5D), efter stimuleringsmønster eller efter en anden kategori.

Representative Results

Vi præsenterer flere eksempler på stimulusmønstre, der vurderer forskellige neurale fænomener, herunder tidsmæssig hæmning, tilpasning og disinhibition. Tidsmæssig hæmning er den øjeblikkelige undertrykkelse af et neuralt respons på en anden stimuluspræsentation, der forekommer kort efter den indledende præsentation¹⁴. For at teste dette fænomen blev der i et parpulseksperiment præsenteret otte mønstre bestående af to 1 s lugtimpulser adskilt af et interval fra 0 s til 20 s (figur 6B; se figur 3B for den tilsvarende stimuluskontrolfil). Arenaen blev oprettet med en enkelt stimulusvæske (1,1 μM diacetyl), buffer og kontrolflowrør, med den ubrugte indløbsport blokeret med en solid stift (figur 6A). Ved at tænde ventil 1 kommer kontrolvæsken ind i ctrl1-indløbet og skifter væskestrømmene, så stimulus kommer ind i arenaen; Når ventil 1 er slukket, kommer kontrolvæsken ind i ctrl2-indløbet, og bufferen strømmer gennem arenaen (se figur 2G, H). Mens den første 1 s lugtpuls fremkaldte en lige responsstørrelse i de diacetyldetekterende AWA-neuroner, varierede reaktionerne på den anden puls med interstimulusintervallet (figur 6D). For pulsintervaller på mindre end 10 s var det andet respons svagere, hvilket demonstrerede det tidsmæssige hæmningsfænomen. Ved hjælp af denne eksperimentelle opsætning viste forstyrrelsen af dyneinkomponenten CHE-3 sig at forhindre tidsmæssig hæmning, hvilket implicerede aksonal transport i dette fænomen⁵.

Tilpasning er det gradvise fald i neurale reaktioner på gentagne præsentationer af den samme stimulus. Dette fænomen kan være forårsaget af forskellige processer, såsom aktiv hæmning, som hurtigt kan vendes, eller andre processer, der er langsomme til at vende. Et eksperiment til vurdering af hurtig reversibilitet er et "catch" -forsøg, hvor en stimulus gentages for at etablere tilpasning, efterfulgt af en "afvigende" eller ny stimulus og derefter en tilbagevenden til den oprindelige stimulus. Disinhibering observeres, hvis de neurale reaktioner øges efter den nye "disinhibiting" stimulus. Figur 7 viser et eksempel ved anvendelse af to lugtstoffer, diacetyl og 2-methylpyrazin (2-MP), detekteret af AWA-kemosensoriske neuroner via forskellige receptorer⁴. To stimulusreservoirer og slanger blev forbundet til den mikrofluidiske enhed med en yderligere trevejs klemmeventil for at bestemme, hvilken stimulus der kommer ind i arenaen (figur 7A). Stimulusmønstrene blev defineret til at præsentere kemiske impulser i 4 s via ventil 1 for alle 30 forsøg og til at vælge mellem stimulus S1 eller S2 via ventil 3, som blev tændt efter det 25. forsøg og slukket efter det 26. (figur 7B). Dette arrangement sikrede tilstrækkelig tid til, at de forskellige stimulusvæsker kunne strømme gennem den mikrofluidiske enhed, før de blev præsenteret for dyrene. Tilpasning blev observeret til diacetylstimulus, men præsentationen af den nye 2-MP-stimulus fremkaldte ikke en stærk disinhiberingseffekt (figur 7C).

Optogenetisk stimulering bruger lys til at aktivere neuroner via lysfølsomme ionkanaler. Selvom det er praktisk at bruge, omgår optogenetisk aktivering sensoriske receptorer og nogle regulatoriske veje, så nogle neurale fænomener kan variere sammenlignet med aktivering af naturlige stimuli. For at teste disse forskelle er multimodale eksperimenter nyttige til at præsentere forskellige typer stimulering inden for et enkelt eksperiment. Neuroner, der udtrykker kanalrhodopsinvarianten Chrimson, aktiveres ved eksponering for rødt lys⁵. For at vurdere, om AWA-neuronerne tilpasser sig på samme måde som kemisk og optogenetisk stimulering, blev NZ1091-stammen, der udtrykte både Chrimson og GCaMP i AWA-neuronerne, opretholdt på en plade indeholdende cofaktoren all-trans-retinal (ATR, 100 μM) i 14-28 timer. En 615 nm rød LED oplyste den mikrofluidiske arena ovenfra (figur 8A), og et sæt multimodale stimulusmønstre blev genereret ved at tilvejebringe 5 s pulser af diacetyl, rødt lys, eller begge dele inden for samme forsøg (figur 8B). Kemisk stimulering alene forårsagede tilpasning, mens optisk stimulering alene ikke gjorde det (figur 8C). Det kombinerede multimodale stimulusmønster viste imidlertid, at optogenetiske reaktioner var modtagelige for kemisk induceret tilpasning (figur 8C, D). Disse eksperimenter tyder på, at tilpasning initieres ved sensoriske receptorer eller dendritiske processer, men dens virkninger spredes gennem neuronen.

Figur 1: Skematisk oversigt over det neurale calciumoptagelses- og stimuleringsudstyr. Mikroskopets billedoptagelse, fluorescensexcitationslys og stimulering styres af en computer og en open source Arduino-mikrocontroller. Den kemiske stimulering i den mikrofluidiske arena skifter mellem buffer B og stimulus S-opløsninger via kontrolvæskestrøm C. De valgfrie systemelementer er angivet med en stjerne (*), såsom ekstra ventiler og optiske eller andre stimuleringsmetoder. Fluorescensmikroskopbillederne bruges til at måle den neurale aktivitet via calciumtransienter, for eksempel ved hjælp af calciumindikatoren GCaMP. De stiplede linjer repræsenterer de elektriske forbindelser (digitale eller analoge), de buede linjer er væskeslangen, og de lige solide pile er de optiske lysbaner. Forkortelse: LED = lysemitterende diode. Dette tal er ændret fra Lawler og Albrecht¹⁵. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Montering og opsætning af mikrofluidisk enhed. Den mikrofluidiske enhed består af en (A) mikromønstret PDMS-enhed klemt mellem en (B) boret glasplade og hydrofob glasbase og (C) fastspændt. (D) Beholderne er placeret over anordningen med et (E) rørstativ. Slangen fra reservoirerne er forbundet enten direkte til enheden eller gennem aktiverede ventiler til væskestyring. Enheden er placeret over målet på mikroskopet. (F) Nærbillede af den mikrofluidiske anordning med alle slanger fastgjort i indsugningerne, snekkens lasteport og udløbet. G) Skematisk oversigt over 20 mm x 20 mm mikrofluidisk anordning. De sorte linjer repræsenterer de 55-70 μm høje væskekanaler. Denne geometri er designet til at give mulighed for præcis rumlig tidsmæssig kontrol med en stimulusfront vinkelret på strømmen, samtidig med at dyrene holdes inden for arenaen og mikroskopets synsfelt. Bufferstrømmen og en stimulusstrøm (eller eventuelt Stim2, hvis den bruges) flyder kontinuerligt, mens kun et kontrolvæskeindløb strømmer ad gangen og skifter, hvilken væske der kommer ind i arenaen. (H) Når ventil 1 får strøm, strømmer kontrolvæsken fra den normalt lukkede port til kontrol1-indløbet, og stimulus tændes og strømmer gennem arenaen. Når ventil 1 er slukket, strømmer væske fra den normalt åbne port til kontrolindløbet2, og bufferen kommer ind i arenaen. Den korrekte flowbalance er vist, med fluoresceinfarvestof anvendt som stimulusvæske. Bemærk, at noget af væsken, der kommer ind i arenaen, også omgår den via de øvre og nedre buede kanaler. Disse vandløb skal være smalle og have samme bredde i de øvre og nedre kanaler. Reservoirhøjderne kan justeres efter behov. Forkortelser: PDMS = polydimethylsiloxan; WL = indlæsning af orm; Buf = buffer; Stim1 = første stimulus; Stim2 = anden stimulus; NC = normalt lukket; NO = normalt åben. Dette tal er ændret fra Lawler og Albrecht¹⁵. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Eksempel på stimulusdefinitionsfiler. (A) Eksempel på enkelt gentaget stimuluseksperiment: en 5 s lyspuls ved intensitet 200 fra 2 s til 7 s (ramme 20 til 70). (B) Eksempel på stimulusforsøg med flere mønstre med otte forskellige stimulusmønstre, svarende til figur 6. To 1 s kemiske impulser præsenteres med et interval på 0 s til 20 s mellem dem. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Valg af neuroner og tærskelniveauer i NeuroTracker . (A) Fuldt mikroskopsynsfelt med lysstyrke og kontrast justeret for tydeligt at se AWA-neuronerne. B) Forstørret billede af et dyrs hovedområde, der viser den integrationsboks, hvorfra fluorescensintensiteten beregnes, og baggrundsannulus for baggrundssubtraktion. (C) Integreret intensitetsplot, der viser et robust neuralt respons. (D) Et godt tærskelvalg vil resultere i et rødt tærskelområde, der er over parameteren Min størrelse og under parameteren Max Size for hvert billede i billedstakken og ikke inkluderer områder i nærheden, såsom tarmautofluorescens (se panel B). (E) En tærskel, der er sat for højt, kan virke god, når neuronen er aktiv, men når den er inaktiv, kan neuronen gå tabt. Det er derfor vigtigt at kontrollere både præstimulerings- og poststimuleringsrammerne, når du vælger en tærskel. (F) En tærskel, der er sat for lavt, kan fremhæve andre ikke-neuronale strukturer. Valg af overtærskel eller under tærskel kan føre til, at NeuroTracker mister neuronen og holder pause for brugerfeedback for at korrigere tærsklen og neuronpositionen. Forkortelse: B&C = lysstyrke og kontrast. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Eksempel på dataanalyse. Neurale reaktioner hos 15 dyr udsat for 10 gentagelser af en 5 s varighed optogenetisk stimulering en gang pr. Minut. (A) Resumébillede, der angiver de dyr, der spores, og neuronernes bevægelse i forsøget (røde bokse). Dyr 2 bevægede sig under forsøget. (B) De enkelte dyrs respons over tid viser et relativt konsistent respons på stimulering af rødt lys. (C) Dataudforskningsoutput ved hjælp af databrowsing-funktionen . Sporingerne grupperes efter gentagelse af forsøg (ovenfor), og gennemsnit vises nedenfor for forsøg, der kan vælges af brugeren. D) Data grupperet efter individuelt dyrenummer og som gennemsnit på tværs af gentagne forsøg. Dette datasæt viser minimal variation mellem dyr, hvilket retfærdiggør gennemsnitlige reaktioner på tværs af populationen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Par-puls eksperiment med et variabelt interstimulus interval for at vurdere tidsmæssig hæmning . A) Indløbsforbindelser for mikrofluidiske anordninger. Det ubrugte indløb blokeres med en solid stift (X). Kontrolvæskebeholderen og ventilen1 er forbundet med c1- og c2-indgangene, udeladt her for klarhedens skyld. (B) Stimulus timing for otte mønstre. Impulserne er 1 s i varighed og adskilt af 0-20 s. Sekvensen af mønstre er afbildet nedenfor; Hvert mønster blev præsenteret seks eller syv gange. (C) AWA neural aktivitet fra 50 forsøg og ni dyr. Et varmekort over svar sorteret efter stimuleringsmønster er vist ovenfor; Den gennemsnitlige neurale aktivitet for hvert mønster (n = 56-63 svar) er vist nedenfor. Tidsmæssig hæmning forekommer i ~ 10 s efter den indledende puls. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Fangstforsøg til vurdering af disinhibition . A) Indsugningsforbindelser til mikrofluidiske anordninger. En trevejs klemmeventil tillader kun stimulus S1 at passere i hvile og kun S2 at passere, når den er aktiveret. (B) Diagram over de tre mønstersekvenser, der anvendes til at levere de gentagne diacetyllugtimpulser, med den nye stimulus 2-methylpyrazin præsenteret på plads i det 26. forsøg. (C) Gennemsnitlig AWA neurale aktivitetsrespons på tværs af 20 dyr. Forkortelser: DA = diacetyl; 2-MP = 2-methylpyrazin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Eksempel på multimodal stimulering . (A) Indløbsforbindelser for mikrofluidiske anordninger, med et ubrugt indtag blokeret med en solid stift. En rød LED oplyser arenaen ovenfra. (B) Mønstre for optisk, kemisk eller multimodal stimulering. (C) Gennemsnitlig AWA neural aktivitet (n = 11 dyr) i 30 gentagne forsøg med parret optogenetisk og kemosensorisk (øverst), kun optogenetisk (midten) og kemosensorisk kun (nederst) stimulering. (D) Peak neural response average for hvert forsøg for optogenetiske pulser ovenfor og kemiske impulser nedenfor. De optogenetiske impulser forårsager ikke direkte tilpasning, men deres reaktioner er modtagelige for kemosensorisk tilpasning. Forkortelser: DA = diacetyl. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

I denne protokol beskriver vi et open-access mikroskopisystem til vurdering af neurale aktivitetsfænomener ved hjælp af tidsmæssigt præcis levering af forskellige stimulusmønstre. Den mikrofluidiske platform leverer gentagelige stimuli, samtidig med at snesevis af dyr holdes i mikroskopets synsfelt. Få kommercielle mikroskopi-softwarepakker giver mulighed for nem programmering af forskellige stimulustimingmønstre, og dem, der gør, kræver ofte manuel indtastning af hvert mønster eller proprietære filformater. I modsætning hertil defineres eksperimenter i dette system af tekstfiler, som kan være computergenererede og kan læses af analysesoftware. Her demonstrerer vi nytten af at anvende variable stimulusmønstre til vurdering af neuronale fænomener som tidsmæssig hæmning, tilpasning og krydstale under multimodal stimulering. Dataanalysepipelinen reducerer store mikroskopivideofiler til neurale aktivitetsdata, der kan visualiseres og analyseres for populationsvariabilitet (figur 5B), ændringer over tid (figur 7C og figur 8C, D) og ændringer efter forstyrrelse (figur 7C).

En vigtig fordel ved automatisering er reproducerbarheden af stimulering på tværs af forsøgsgentagelser og mellem eksperimenter, og det mikrofluidiske arenaformat tillader mindst en 20 gange stigning i gennemstrømning sammenlignet med tidligere enkeltdyrsmetoder ^7,9,13. Ved at udsætte en population af dyr for de samme stimulus- og miljøforhold sikres det, at dataene er sammenlignelige og undgår potentielle daglige variationer i opløsningsforberedelse, temperatur, animalske kilder eller andre faktorer. En begrænsning af denne tilgang er imidlertid mikroskopi med lav forstørrelse, lav opløsning, der holder alle dyrene i synsfeltet. Kun en neuron bør overvåges pr. dyr for at minimere sporingsfejl, selvom neuroner adskilt af mindst 50 μm i princippet kan skelnes. Bilaterale neuronpar kan afbildes sammen, hvis svarene forventes at være symmetriske. Det er vigtigt først at identificere, hvilke specifikke neuroner der er involveret i en neural proces af interesse, såsom ved helhjernebilleddannelse⁷, og derefter kun udtrykke GCaMP i de relevante neuroner for øget gennemstrømning.

Neuronale calciumresponser varierer fra dyr til dyr på grund af reporterekspressionsniveauer eller andre interindividuelle forskelle. For eksempel varierer normaliserede AWA GCaMP-reaktioner dobbelt i topstørrelse, selv hos isogene vildtypedyr med calciumreporteren stabilt integreret i genomet⁴. Nogle stimuli viser variable reaktioner på tværs af befolkningen (fx butylacetat⁴), hvilket tyder på variabel receptorekspression. I praksis bør mindst 20 individuelle dyr vurderes for at bestemme populationsvariationen. Det anbefales at gøre brug af individuelle dyredata for at øge den statistiske styrke til bestemmelse af responsændringer, såsom ved statistisk sammenligning af individuelle neurale responser parret før og efter en forstyrrelse.

Med store datasæt og automatiserede eksperimenter er det vigtigt at validere og verificere korrekt eksperimentfunktion, sporing og datareduktion, især for uovervågede trin. Flowmønstre bør verificeres med fluorescerende opløsninger (som i figur 2H) ved at observere, at der ikke kommer bobler eller kontrolvæske ind i arenaen i de optagede videoer. Datasæt bør valideres ved f.eks. at notere enhver flytning af dyr (som i figur 5A) og verificere glatte neurale reaktioner (som i figur 4C og figur 5B). Eventuelle problematiske data bør udelukkes. Det er også vigtigt at verificere datagruppering før gennemsnit ved hjælp af funktionen "databrowse" for at sikre, at det gennemsnitlige svar afspejler individuelle svar.

Open source-stimuleringskontrolsystemet kan let udvides til andre stimuli via digitale eller analoge signaler eller serielle kommunikationskommandoer. Graduerede stimuli kan typisk styres af analoge spændingsindgange (0-5 V), såsom LED-lysintensitet eller nervestimulatorpulsstørrelse. On-off stimuli styres typisk med digitale (TTL) signaler, såsom elektrisk stimulator timing. Disse digitale signaler kan også aktivere relæafbrydere for at aktivere andre elektriske systemer, såsom vibrationsmotorer til mekanosensorisk stimulering. Andet udstyr bruger seriel kommunikation, såsom via USB-forbindelse, med specifikke tegnkommandoer, der overføres for at definere handlinger. For eksempel kan dosis-respons-eksperimenter præsentere flere kemiske koncentrationer automatisk ved hjælp af en USB-styret rotationsventil⁵ eller multibrøndpladesystem⁶. Disse kommandoer kan føjes til open source-mikroskopkontrolscripts, der skal sendes til bestemte prøvenumre. Tidsforsinkelser kan ligeledes indarbejdes; For eksempel, for at sætte testen på pause i 1 time mellem to 30 forsøgsstimuleringsanfald, ville man specificere et 60-forsøgseksperiment og tilføje en enkelt kodelinje for at holde pause i 1 time, når forsøgsnummeret når 31.

Den eksperimentelle kompleksitet er næsten ubegrænset og kan endda ændre sig under et eksperiment baseret på live feedback i et "lukket kredsløb" -system. For eksempel kan stimuleringen variere i realtid baseret på den neurale aktivitet, dyreadfærd eller en anden kvantificerbar parameter. Vi brugte for nylig et sådant system til at vurdere de sensoriske neurale reaktioner hos sovende versus vågne dyr ved at udløse stimulering og neural optagelse efter en ændring i adfærd ^8,15. Bevægelsessporingsfunktionen i NeuroTracker muliggør analyse af neural aktivitet i dyr, der bevæger sig frit, for korrelation til adfærdsoutput. Sporing af individuelle bevægelige dyr kræver dog nøje opmærksomhed, såsom når de krydser stier, og det anbefales derfor at indlæse færre dyr pr. arena (omkring fem) for at minimere disse interaktioner.

Samlet set øger disse teknikker præcisionen af stimulering og den eksperimentelle gennemstrømning i udforskning af populationsvariabilitet og specifikke neurale fænomener. Ud over at måle neuronal aktivitet kan disse metoder generaliseres til andre biosystemer, herunder planter, som også kommunikerer via calciumsignaler²¹, neural cellekultur og hjerneorganoider 22 samt til andre dynamiske fluorescerende signaler, såsom sensorer til synaptisk aktivitet, neurotransmitterfrigivelse 23 og transkription²⁴.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial strains
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Experimental models: Organisms/strains
C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work	NZ1091, for example
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanedione	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetyl, example chemical stimulus
Calcium chloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluorescein, Sodium salt	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Glass water repellant	Rain-X	Cat #800002250	glass hydrophobic treatment (single-use)
Magnesium chloride, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Nematode Growth Medium (NGM) agar	Genesee	Cat #: 20-273NGM
Petri dishes (60 mm)	Tritech	Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Sodium chloride, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	glass hydrophobic treatment (durable)
Software and algorithms
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager	Micro-manager	https://micro-manager.org/
Microscope control software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker data analysis software	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automated Microscope and Stimulation System
Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Valve 1: Control
2-way normally-closed (NC) Pinch Valve	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Valve 2: Outflow
3-way Pinch Valve	NResearch	Cat #161P091	Valve 3: Stimulus selection
Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digital/manual valve controller	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Wires and connectors	various	See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel variable speed rotary cutter 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Set speed to 5k RPM for cutting glass
Dremel drill press rotary tool workstation	Dremel	Cat #220-01
Diamond drill bit	Dremel	Cat #7134
Glass slide, 1 mm thick	VWR	Cat #75799-268
Glass scribe (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer 3-way stopcock	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G blunt needle	VWR	Cat #89134-100
Microfluidic device	Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article	N/A
Microfluidic device clamp	Warner Instruments (or machine shop)	P-2
Microfluidic tubing, 0.02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tube 19 G, 0.5″	New England Small Tube	Cat #NE-1027-12