Apresentamos um método para a estimulação química flexível e multimodal e registro da atividade neural simultânea de muitos vermes Caenorhabditis elegans . Esse método usa microfluídica, hardware e software de código aberto e análise automatizada supervisionada de dados para permitir a medição de fenômenos neuronais como adaptação, inibição temporal e crosstalk de estímulos.
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Artigo de método
Estimulação Multimodal Automatizada e Gravação Neuronal Simultânea de Múltiplos Pequenos Organismos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Indicadores fluorescentes de cálcio codificados geneticamente têm contribuído muito para a nossa compreensão da dinâmica neural, desde o nível de neurônios individuais até circuitos cerebrais inteiros. No entanto, as respostas neurais podem variar devido à experiência prévia, estados internos ou fatores estocásticos, gerando a necessidade de métodos que possam avaliar a função neural em vários indivíduos ao mesmo tempo. Enquanto a maioria das técnicas de registro examina um único animal de cada vez, descrevemos o uso de microscopia de campo largo para ampliar registros neuronais para dezenas de Caenorhabditis elegans ou outros organismos de escala submilimétrica ao mesmo tempo. Hardware e software de código aberto permitem grande flexibilidade na programação de experimentos totalmente automatizados que controlam a intensidade e o tempo de vários tipos de estímulos, incluindo estímulos químicos, ópticos, mecânicos, térmicos e eletromagnéticos. Em particular, os dispositivos de fluxo microfluídico fornecem controle preciso, repetível e quantitativo de estímulos quimiossensoriais com resolução de tempo inferior a um segundo. O pipeline de análise de dados semi-automatizado do NeuroTracker extrai respostas neurais individuais e populacionais para descobrir mudanças funcionais na excitabilidade e dinâmica neural. Este artigo apresenta exemplos de medidas de adaptação neuronal, inibição temporal e crosstalk de estímulos. Essas técnicas aumentam a precisão e a repetibilidade da estimulação, permitem a exploração da variabilidade populacional e são generalizáveis para outros sinais fluorescentes dinâmicos em pequenos biossistemas, desde células e organoides até organismos inteiros e plantas.
Introdução
Técnicas de imagem com cálcio têm permitido o registro não invasivo da dinâmica neural in vivo em tempo real utilizando microscopia de fluorescência e indicadores de cálcio codificados geneticamente, expressos em células-alvo 1,2,3. Esses sensores normalmente usam uma proteína fluorescente verde (GFP), como a família do peptídeo GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar a intensidade da fluorescência após a ativação neuronal e níveis elevados de cálcio intracelular. A imagem do cálcio tem sido especialmente poderosa no nematoide C. elegans para examinar com....
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Protocolo
1. Equipamento de imagem neural
NOTA: Veja Lawler e Albrecht15 para obter instruções detalhadas sobre a construção do sistema de imagem e estimulação, que controla o tempo de iluminação do microscópio, a aquisição da imagem e a entrega de estímulos (Figura 1). Um controlador de estímulo Arduino Nano de baixo custo aciona as válvulas fluídicas através de sinais digitais para um controlador de válvulas e controla a iluminação optogenética através de sinais de tensão analógicos para um controlador LED. Outros estímulos, como motores de vibração e aquecedores térmicos, podem s....
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Resultados
Apresentamos vários exemplos de padrões de estímulos que avaliam diferentes fenômenos neurais, incluindo inibição temporal, adaptação e desinibição. A inibição temporal é a supressão momentânea de uma resposta neural à apresentação de um segundo estímulo que ocorre logo após a apresentação inicial14. Para testar esse fenômeno, em um experimento de pulso pareado, oito padrões consistindo de dois pulsos odorantes de 1 s separados por um intervalo que variava de 0 s a 20 s foram apre.......
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Discussão
Neste protocolo, descrevemos um sistema de microscopia de acesso aberto para a avaliação de fenômenos de atividade neural usando a entrega temporalmente precisa de diferentes padrões de estímulo. A plataforma microfluídica fornece estímulos repetíveis enquanto mantém dezenas de animais no campo de visão do microscópio. Poucos pacotes de software de microscopia comercial permitem a fácil programação de vários padrões de temporização de estímulos, e aqueles que o fazem geralmente exigem a entrada manual de cada padrão ou f.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos à Fox Avery por testar esses protocolos e revisar o manuscrito e a Eric Hall pela assistência na programação. O financiamento para os métodos aqui apresentados foi fornecido em parte pela National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| cepas bacterianas | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Modelos experimentais: Organismos/cepas | |||
| C. cepas elegans expressando GCaMP (e, opcionalmente, Chrimson) em neurônios desejados | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ou autores correspondentes do trabalho publicado | NZ1091, por exemplo | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanodiona | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetil, exemplo químico estímulo |
| Cloreto de cálcio, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluoresceína, Sal de sódio | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Repelente de água de vidro | Rain-X | Cat #800002250 | tratamento hidrofóbico de vidro (uso único) |
| Cloreto de magnésio, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Ágar Meio de Crescimento de Nematóides (NGM) | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Placas de Petri (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poli (dimetil siloxano) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Fosfato de potássio monobásico | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Fosfato de potássio dibásico | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Cloreto de sódio, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)triclorossilano (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | tratamento hidrofóbico de vidro (durável) |
| Software e algoritmos | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Software de controle de microscópio | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker software de análise de dados | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Microscópio Automatizado e Sistema de Estimulação | |||
| Axio Observer.A1 microscópio invertido configurado para epifluorescência (cubos de filtro GFP, 5&vezes; objetiva ou similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS Iluminador LED | Excelitas Cat | #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Câmera digital sCMOS | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino Cat | #A000005 | |
| Válvula de isolamento diapragma em miniatura de 3 vias (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Válvula 1: Controle |
| 2 vias normalmente fechadas (NC) Válvula de aperto | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Válvula 2: |
| Válvula de aperto de 3 vias | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus seleção |
| LED e controlador de estimulação optogenética (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S e #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 controlador de válvula digital/manual | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Fios e conectores | vários | Consulte a Fig. 2 do Protocolo Cell STARS (Lawler, 2021) | |
| Preparação do dispositivo microfluídico | |||
| Cortador rotativo de velocidade variável Dremel 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Defina a velocidade para 5k RPM para cortar vidro |
| Estação de trabalho de ferramentas rotativas de furadeira Dremel | Dremel | Cat #220-01 | |
| Dremel | Cat #7134 | ||
| Slide de vidro, 1 mm de espessura | VWR | Cat #75799-268 | |
| Scriber de vidro (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer torneira de 3 vias | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G agulha romba | VWR | Cat #89134-100 | |
| Dispositivo microfluídico | Correspondente autor ou fabricação a partir de arquivos CAD associados a este artigo | N/A | |
| Grampo de dispositivo microfluídico | Warner Instruments (ou oficina de máquinas) | P-2 | |
| Tubulação microfluídica, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tubo 19 G, 0.5″ | Gato de tubo pequeno New England | #NE-1027-12 |
Referências
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H.
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Reimpressões e permissões
