Estimulação Multimodal Automatizada e Gravação Neuronal Simultânea de Múltiplos Pequenos Organismos

Summary

Apresentamos um método para a estimulação química flexível e multimodal e registro da atividade neural simultânea de muitos vermes Caenorhabditis elegans . Esse método usa microfluídica, hardware e software de código aberto e análise automatizada supervisionada de dados para permitir a medição de fenômenos neuronais como adaptação, inibição temporal e crosstalk de estímulos.

Abstract

Indicadores fluorescentes de cálcio codificados geneticamente têm contribuído muito para a nossa compreensão da dinâmica neural, desde o nível de neurônios individuais até circuitos cerebrais inteiros. No entanto, as respostas neurais podem variar devido à experiência prévia, estados internos ou fatores estocásticos, gerando a necessidade de métodos que possam avaliar a função neural em vários indivíduos ao mesmo tempo. Enquanto a maioria das técnicas de registro examina um único animal de cada vez, descrevemos o uso de microscopia de campo largo para ampliar registros neuronais para dezenas de Caenorhabditis elegans ou outros organismos de escala submilimétrica ao mesmo tempo. Hardware e software de código aberto permitem grande flexibilidade na programação de experimentos totalmente automatizados que controlam a intensidade e o tempo de vários tipos de estímulos, incluindo estímulos químicos, ópticos, mecânicos, térmicos e eletromagnéticos. Em particular, os dispositivos de fluxo microfluídico fornecem controle preciso, repetível e quantitativo de estímulos quimiossensoriais com resolução de tempo inferior a um segundo. O pipeline de análise de dados semi-automatizado do NeuroTracker extrai respostas neurais individuais e populacionais para descobrir mudanças funcionais na excitabilidade e dinâmica neural. Este artigo apresenta exemplos de medidas de adaptação neuronal, inibição temporal e crosstalk de estímulos. Essas técnicas aumentam a precisão e a repetibilidade da estimulação, permitem a exploração da variabilidade populacional e são generalizáveis para outros sinais fluorescentes dinâmicos em pequenos biossistemas, desde células e organoides até organismos inteiros e plantas.

Introduction

Técnicas de imagem com cálcio têm permitido o registro não invasivo da dinâmica neural in vivo em tempo real utilizando microscopia de fluorescência e indicadores de cálcio codificados geneticamente, expressos em células-alvo ^1,2,3. Esses sensores normalmente usam uma proteína fluorescente verde (GFP), como a família do peptídeo GFP-calmodulina-M13 (GCaMP), para aumentar a intensidade da fluorescência após a ativação neuronal e níveis elevados de cálcio intracelular. A imagem do cálcio tem sido especialmente poderosa no nematoide C. elegans para examinar com....

Protocol

1. Equipamento de imagem neural

NOTA: Veja Lawler e Albrecht¹⁵ para obter instruções detalhadas sobre a construção do sistema de imagem e estimulação, que controla o tempo de iluminação do microscópio, a aquisição da imagem e a entrega de estímulos (Figura 1). Um controlador de estímulo Arduino Nano de baixo custo aciona as válvulas fluídicas através de sinais digitais para um controlador de válvulas e controla a iluminação optogenética através de sinais de tensão analógicos para um controlador LED. Outros estímulos, como motores de vibração e aquecedores térmicos, podem s....

Results

Apresentamos vários exemplos de padrões de estímulos que avaliam diferentes fenômenos neurais, incluindo inibição temporal, adaptação e desinibição. A inibição temporal é a supressão momentânea de uma resposta neural à apresentação de um segundo estímulo que ocorre logo após a apresentação inicial¹⁴. Para testar esse fenômeno, em um experimento de pulso pareado, oito padrões consistindo de dois pulsos odorantes de 1 s separados por um intervalo que variava de 0 s a 20 s foram apre.......

Discussion

Neste protocolo, descrevemos um sistema de microscopia de acesso aberto para a avaliação de fenômenos de atividade neural usando a entrega temporalmente precisa de diferentes padrões de estímulo. A plataforma microfluídica fornece estímulos repetíveis enquanto mantém dezenas de animais no campo de visão do microscópio. Poucos pacotes de software de microscopia comercial permitem a fácil programação de vários padrões de temporização de estímulos, e aqueles que o fazem geralmente exigem a entrada manual de cada padrão ou f.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
cepas bacterianas
E.  coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Modelos experimentais: Organismos/cepas
C.  cepas elegans expressando GCaMP (e, opcionalmente, Chrimson) em neurônios desejados	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ou autores correspondentes do trabalho publicado	NZ1091, por exemplo
Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butanodiona	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetil, exemplo químico estímulo
Cloreto de cálcio, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluoresceína, Sal de sódio	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Repelente de água de vidro	Rain-X	Cat #800002250	tratamento hidrofóbico de vidro (uso único)
Cloreto de magnésio, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Ágar Meio de Crescimento de Nematóides (NGM)	Genesee	Cat #: 20-273NGM
Placas de Petri (60  mm)	Tritech	Cat #T3305
Poli (dimetil siloxano) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Fosfato de potássio dibásico	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Cloreto de sódio, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)triclorossilano (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	tratamento hidrofóbico de vidro (durável)
Software e algoritmos
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager	Micro-manager	https://micro-manager.org/
Software de controle de microscópio	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker software de análise de dados	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Microscópio Automatizado e Sistema de Estimulação
Axio Observer.A1 microscópio invertido configurado para epifluorescência (cubos de filtro GFP, 5&vezes; objetiva ou similar)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS Iluminador LED	Excelitas Cat	#XYLIS
Orca Flash 4.0 Câmera digital sCMOS	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino Cat	#A000005
Válvula de isolamento diapragma em miniatura de 3 vias (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Válvula 1: Controle
2 vias normalmente fechadas (NC) Válvula de aperto	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Válvula 2:
Válvula de aperto de 3 vias	NResearch	Cat #161P091	Valve 3: Stimulus seleção
LED e controlador de estimulação optogenética (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S e #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 controlador de válvula digital/manual	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Fios e conectores	vários	Consulte a Fig. 2 do Protocolo Cell STARS (Lawler, 2021)
Preparação do dispositivo microfluídico
Cortador rotativo de velocidade variável Dremel 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Defina a velocidade para 5k RPM para cortar vidro
Estação de trabalho de ferramentas rotativas de furadeira Dremel	Dremel	Cat #220-01
	Dremel	Cat #7134
Slide de vidro, 1  mm de espessura	VWR	Cat #75799-268
Scriber de vidro (Diamond scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer torneira de 3 vias	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G agulha romba	VWR	Cat #89134-100
Dispositivo microfluídico	Correspondente autor ou fabricação a partir de arquivos CAD associados a este artigo	N/A
Grampo de dispositivo microfluídico	Warner Instruments (ou oficina de máquinas)	P-2
Tubulação microfluídica, 0.02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tubo 19 G, 0.5″	Gato de tubo pequeno New England	#NE-1027-12