Stimulation multimodale automatisée et enregistrement neuronal simultané à partir de plusieurs petits organismes
Summary
Nous présentons une méthode pour la stimulation chimique flexible et multimodale et l’enregistrement de l’activité neuronale simultanée de nombreux vers Caenorhabditis elegans . Cette méthode utilise la microfluidique, du matériel et des logiciels open source et une analyse automatisée supervisée des données pour permettre la mesure de phénomènes neuronaux tels que l’adaptation, l’inhibition temporelle et la diaphonie de stimulus.
Abstract
Les indicateurs de calcium fluorescents codés génétiquement ont grandement contribué à notre compréhension de la dynamique neuronale depuis le niveau des neurones individuels jusqu’à des circuits cérébraux entiers. Cependant, les réponses neuronales peuvent varier en raison de l’expérience antérieure, des états internes ou des facteurs stochastiques, générant ainsi le besoin de méthodes permettant d’évaluer la fonction neuronale chez de nombreux individus à la fois. Alors que la plupart des techniques d’enregistrement examinent un seul animal à la fois, nous décrivons l’utilisation de la microscopie à grand champ pour étendre les enregistrements neuronaux à des dizaines de Caenorhabditis elegans ou d’autres organismes à l’échelle inférieure à la fois. Le matériel et les logiciels open source offrent une grande flexibilité dans la programmation d’expériences entièrement automatisées qui contrôlent l’intensité et le moment de divers types de stimulus, y compris les stimuli chimiques, optiques, mécaniques, thermiques et électromagnétiques. En particulier, les dispositifs d’écoulement microfluidique fournissent un contrôle précis, reproductible et quantitatif des stimuli chimiosensoriels avec une résolution temporelle inférieure à la seconde. Le pipeline d’analyse de données semi-automatisé NeuroTracker extrait ensuite les réponses neuronales individuelles et à l’échelle de la population pour découvrir les changements fonctionnels dans l’excitabilité et la dynamique neuronales. Cet article présente des exemples de mesure de l’adaptation neuronale, de l’inhibition temporelle et de la diaphonie stimulus. Ces techniques augmentent la précision et la répétabilité de la stimulation, permettent l’exploration de la variabilité de la population et sont généralisables à d’autres signaux fluorescents dynamiques dans de petits biosystèmes, des cellules et organoïdes aux organismes entiers et aux plantes.
Introduction
Les techniques d’imagerie calcique ont permis l’enregistrement non invasif de la dynamique neuronale in vivo en temps réel à l’aide de la microscopie à fluorescence et d’indicateurs de calcium génétiquement codés exprimés dans les cellules cibles 1,2,3. Ces capteurs utilisent généralement une protéine fluorescente verte (GFP), telle que la famille de peptides GFP-calmodulin-M13 (GCaMP), pour augmenter l’intensité de fluorescence lors de l’activation neuronale et des niveaux élevés de calcium intracellulaire. L’imagerie calcique a été particulièrement puissante chez le nématode C. elegans pour examiner comment les neurones et les circuits neuronaux fonctionnent chez les animaux vivantsau comportement 4,5,6,7,8,9,10, car leur nature transparente signifie qu’aucun processus chirurgical n’est nécessaire pour l’accès optique, et les promoteurs de gènes spécifiques aux cellules ciblent l’expression des cellules d’intérêt. Ces techniques utilisent souvent des dispositifs microfluidiques, qui fournissent des environnements contrôlés avec précision pour étudier les phénomènes biologiques, chimiques et physiques à petite échellephysique 11,12. Les dispositifs microfluidiques abondent pour mesurer l’activité neuronale, avec de nouvelles conceptions continuellement en développement, et ils sont facilement fabriqués dans le laboratoire de recherche. Cependant, de nombreux modèles piègent un seul animal à la fois, limitant le débit expérimental 7,9,13. Les réponses neuronales varient souvent considérablement d’un animal à l’autre en raison de différences dans l’expérience antérieure, d’états internes tels que le stress ou la faim, ou de facteurs stochastiques tels que les niveaux d’expression génique. Ces différences établissent un besoin de méthodes capables simultanément de stimuler et d’observer de nombreux animaux et d’extraire des informations des individus4.
De plus, certains phénomènes neuromodulateurs ne se manifestent que dans des conditions de stimulation spécifiques, comme l’inhibition temporelle14, qui fait référence à la brève suppression des réponses lorsque la stimulation se produit en succession rapide. Les systèmes électrophysiologiques peuvent conduire l’activité neuronale à travers un large espace de stimulus à cette fin, modulant, par exemple, le courant d’impulsion électrique, la tension, la fréquence, la forme d’onde, le cycle de service et la synchronisation des trains de stimulus périodiques. La stimulation indirecte par des stimuli ou des systèmes optogénétiques détectés naturellement bénéficierait d’une gamme similaire de mécanismes de contrôle. Actuellement, de nombreux stimuli naturels sont présentés de manière simple « on-off », tels que la présentation et l’élimination des odeurs, en utilisant des systèmes commerciaux qui ont été lents à ajouter de la flexibilité. Cependant, les microcontrôleurs peu coûteux peuvent désormais automatiser la livraison de plusieurs types de stimuli d’une manière personnalisable en fonction des besoins des chercheurs. Combinés à la microfluidique, ces systèmes ont atteint l’objectif d’augmenter le débit expérimental et la flexibilité, permettant de mesurer simultanément les réponses neuronales à une variété de stimuli précis chez de nombreux animaux 4,6. La stimulation multimodale peut être utilisée pour interroger davantage les circuits neuronaux, par exemple en surveillant les changements dans l’excitabilité neuronale lors d’une stimulation constante avant, pendant et après une perturbation orthogonale telle que l’exposition à un médicament4. Les avantages des systèmes de microscopie ouverts peu coûteux sont évidents pour faire progresser la recherche scientifique, mais dans la pratique, la nécessité d’approvisionnement en pièces, de construction et de validation des performances peut entraver l’adoption de ces techniques.
Ce protocole vise à atténuer certains de ces défis techniques. Alors que les protocoles précédents se sont concentrés sur l’utilisation de dispositifs microfluidiques et la stimulation de base 9,15,17, nous décrivons ici la construction et l’utilisation d’un système de distribution de stimulus flexible, automatisé et multimodal pour l’imagerie neuronale chez C. elegans ou d’autres petits organismes utilisant des dispositifs microfluidiquesdécrits précédemment 4. Le système open-source est programmé via de simples fichiers texte pour définir les expériences, et le programme d’analyse de données NeuroTracker extrait semi-automatiquement les données d’activité neuronale des vidéos du microscope. Nous démontrons ce système avec des exemples d’évaluation de l’inhibition temporelle, de la désinhibition et de la diaphonie de stimulus à l’aide du neurone chimiosensoriel AWA, qui se dépolarise en réponse à différentes odeurs alimentaires ou en réponse à la lumière lors de l’expression de canaux ioniques optogénétiques sensibles à la lumière 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons un système de microscopie en libre accès pour l’évaluation des phénomènes d’activité neuronale en utilisant la livraison temporellement précise de différents modèles de stimulus. La plate-forme microfluidique fournit des stimuli reproductibles tout en maintenant des dizaines d’animaux dans le champ de vision du microscope. Peu de logiciels de microscopie commerciaux permettent de programmer facilement divers modèles de synchronisation de stimulus, et ceux qui le font né…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Fox Avery d’avoir testé ces protocoles et d’avoir révisé le manuscrit et Eric Hall pour son aide à la programmation. Le financement des méthodes présentées ici a été fourni en partie par la National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).
Materials
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
Referências
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).
