Автоматизированная мультимодальная стимуляция и одновременная запись нейронов от нескольких мелких организмов
Summary
Представлен метод гибкой химической и мультимодальной стимуляции и регистрации одновременной нейронной активности многих червей Caenorhabditis elegans . Этот метод использует микрофлюидику, аппаратное и программное обеспечение с открытым исходным кодом, а также контролируемый автоматизированный анализ данных для измерения нейронных явлений, таких как адаптация, временное торможение и перекрестные помехи стимула.
Abstract
Флуоресцентные генетически кодируемые кальциевые индикаторы внесли большой вклад в наше понимание нейронной динамики от уровня отдельных нейронов до целых мозговых цепей. Однако нейронные реакции могут варьироваться в зависимости от предыдущего опыта, внутренних состояний или стохастических факторов, что порождает потребность в методах, которые могут оценивать нейронную функцию у многих людей одновременно. В то время как большинство методов регистрации исследуют одно животное за раз, мы описываем использование широкопольной микроскопии для масштабирования нейронных записей до десятков Caenorhabditis elegans или других организмов субмиллиметрового масштаба одновременно. Аппаратное и программное обеспечение с открытым исходным кодом обеспечивает большую гибкость при программировании полностью автоматизированных экспериментов, которые контролируют интенсивность и время различных типов стимулов, включая химические, оптические, механические, тепловые и электромагнитные стимулы. В частности, микрофлюидные проточные устройства обеспечивают точный, воспроизводимый и количественный контроль хемосенсорных стимулов с временным разрешением менее секунды. Затем полуавтоматический конвейер анализа данных NeuroTracker извлекает индивидуальные и общепопуляционные нейронные ответы, чтобы выявить функциональные изменения в нервной возбудимости и динамике. В этой статье представлены примеры измерения нейрональной адаптации, временного торможения и перекрестных помех стимулов. Эти методы повышают точность и повторяемость стимуляции, позволяют исследовать изменчивость популяции и могут быть обобщены на другие динамические флуоресцентные сигналы в небольших биосистемах от клеток и органоидов до целых организмов и растений.
Introduction
Методы визуализации кальция позволили неинвазивно регистрировать нейронную динамику in vivo в режиме реального времени с использованием флуоресцентной микроскопии и генетически кодируемых кальциевых индикаторов, экспрессируемых в клетках-мишенях 1,2,3. Эти датчики обычно используют зеленый флуоресцентный белок (GFP), такой как семейство пептидов GFP-кальмодулин-M13 (GCaMP), для увеличения интенсивности флуоресценции при активации нейронов и повышении внутриклеточного уровня кальция. Визуализация кальция была особенно мощной у нематоды C. elegans для изучения того, как функционируют нейроны и нейронные цепи у живых, ведущих себя животных 4,5,6,7,8,9,10, поскольку их прозрачная природа означает, что для оптического доступа не требуется хирургического процесса, а промоторы генов, специфичные для клеток, нацелены на экспрессию в интересующие клетки. В этих методах часто используются микрофлюидные устройства, которые обеспечивают точно контролируемую среду для изучения биологических, химических и физических явлений в небольшом физическом масштабе11,12. Микрофлюидные устройства изобилуют для измерения нейронной активности, с новыми конструкциями, постоянно разрабатываемыми, и они легко изготавливаются в исследовательской лаборатории. Однако многие конструкции ловят по одному животному за раз, ограничивая экспериментальную пропускную способность 7,9,13. Нейронные реакции часто существенно различаются у разных животных из-за различий в предыдущем опыте, внутренних состояниях, таких как стресс или голод, или стохастических факторах, таких как уровни экспрессии генов. Эти различия устанавливают потребность в методах, которые могут одновременно стимулировать и наблюдать за многими животными и извлекать информацию из особей4.
Кроме того, некоторые нейромодулирующие явления становятся очевидными только при определенных условиях стимуляции, таких как временное торможение14, которое относится к кратковременному подавлению реакций, когда стимуляция происходит в быстрой последовательности. Для этой цели электрофизиологические системы могут управлять нейронной активностью в широком пространстве стимулов, модулируя, например, электрический импульсный ток, напряжение, частоту, форму волны, рабочий цикл и время периодических поездов стимулов. Косвенная стимуляция естественно обнаруженными стимулами или оптогенетическими системами выиграет от аналогичной широты механизмов контроля. В настоящее время многие естественные стимулы представлены простым способом «включения-выключения», такими как представление и удаление запаха, с использованием коммерческих систем, которые медленно добавляли гибкость. Тем не менее, недорогие микроконтроллеры теперь могут автоматизировать доставку нескольких типов стимулов таким образом, чтобы их можно было настроить в соответствии с потребностями исследователей. В сочетании с микрофлюидикой эти системы достигли цели увеличения экспериментальной пропускной способности и гибкости, что позволило одновременно измерять нейронные реакции на различные точные стимулы у многих животных 4,6. Мультимодальная стимуляция может быть использована для дальнейшего опроса нейронных схем, например, путем мониторинга изменений нервной возбудимости при последовательной стимуляции до, во время и после ортогонального возмущения, такого как воздействие лекарственного средства4. Преимущества недорогих открытых микроскопических систем очевидны для продвижения научных исследований, но на практике потребность в поиске деталей, изготовлении и проверке производительности может препятствовать внедрению этих методов.
Этот протокол направлен на смягчение некоторых из этих технических проблем. В то время как предыдущие протоколы были сосредоточены на использовании микрофлюидных устройств и базовой стимуляции 9,15,17, мы описываем здесь построение и использование гибкой, автоматизированной, мультимодальной системы доставки стимулов для нейронной визуализации у C. elegans или других малых организмов с использованием ранее описанных микрофлюидных устройств 4. Система с открытым исходным кодом запрограммирована с помощью простых текстовых файлов для определения экспериментов, а программа анализа данных NeuroTracker полуавтоматически извлекает данные о нейронной активности из видео микроскопа. Мы демонстрируем эту систему на примерах оценки временного торможения, растормаживания и перекрестных помех стимулов с использованием хемосенсорного нейрона AWA, который деполяризуется в ответ на различные запахи пищи или в ответ на свет при экспрессии оптогенетических светочувствительных ионных каналов 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы описываем систему микроскопии открытого доступа для оценки явлений нейронной активности с использованием точной доставки различных стимульных паттернов. Микрофлюидная платформа обеспечивает повторяющиеся стимулы, удерживая десятки животных в поле зрения микрос…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Фокса Эйвери за тестирование этих протоколов и рецензирование рукописи, а также Эрика Холла за помощь в программировании. Финансирование методов, представленных в настоящем документе, было частично предоставлено Национальным научным фондом 1724026 (D.R.A.).
Materials
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).
