Otomatik Multimodal Stimülasyon ve Birden Çok Küçük Organizmadan Eşzamanlı Nöronal Kayıt
Summary
Birçok Caenorhabditis elegans solucanından esnek kimyasal ve multimodal stimülasyon ve eşzamanlı nöral aktivitenin kaydedilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, adaptasyon, zamansal inhibisyon ve uyaran çapraz konuşması gibi nöronal fenomenlerin ölçülmesini sağlamak için mikroakışkanlar, açık kaynaklı donanım ve yazılım ve denetimli otomatik veri analizi kullanır.
Abstract
Floresan genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, bireysel nöronların seviyesinden tüm beyin devrelerine kadar nöral dinamikleri anlamamıza büyük katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, nöral tepkiler önceki deneyimlere, içsel durumlara veya stokastik faktörlere bağlı olarak değişebilir, bu nedenle birçok bireyde aynı anda nöral fonksiyonu değerlendirebilecek yöntemlere ihtiyaç duyulur. Çoğu kayıt tekniği bir seferde tek bir hayvanı incelerken, nöronal kayıtları aynı anda düzinelerce Caenorhabditis elegans veya diğer milimetre altı ölçekli organizmalara ölçeklendirmek için geniş alan mikroskobunun kullanımını açıklıyoruz. Açık kaynaklı donanım ve yazılım, kimyasal, optik, mekanik, termal ve elektromanyetik uyaranlar dahil olmak üzere çeşitli uyaran türlerinin yoğunluğunu ve zamanlamasını kontrol eden tam otomatik deneylerin programlanmasında büyük esneklik sağlar. Özellikle, mikroakışkan akış cihazları, kemosensoriyel uyaranların saniyenin altında çözünürlükle hassas, tekrarlanabilir ve kantitatif kontrolünü sağlar. NeuroTracker yarı otomatik veri analizi boru hattı daha sonra sinirsel uyarılabilirlik ve dinamiklerdeki fonksiyonel değişiklikleri ortaya çıkarmak için bireysel ve popülasyon çapında sinirsel tepkileri çıkarır. Bu yazıda nöronal adaptasyon, temporal inhibisyon ve uyaran crosstalk’unun ölçülmesine ilişkin örnekler sunulmaktadır. Bu teknikler stimülasyonun hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini arttırır, popülasyon değişkenliğinin araştırılmasına izin verir ve hücrelerden ve organoidlerden tüm organizmalara ve bitkilere kadar küçük biyosistemlerdeki diğer dinamik floresan sinyallere genellenebilir.
Introduction
Kalsiyum görüntüleme teknikleri, floresan mikroskobu ve hedef hücrelerdeeksprese edilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri 1,2,3 kullanılarak in vivo nöral dinamiklerin gerçek zamanlı olarak noninvaziv olarak kaydedilmesini sağlamıştır. Bu sensörler tipik olarak, nöronal aktivasyon ve yüksek hücre içi kalsiyum seviyeleri üzerine floresan yoğunluğunu arttırmak için GFP-kalmodulin-M13 peptid (GCaMP) ailesi gibi yeşil bir floresan protein (GFP) kullanır. Kalsiyum görüntüleme, nöronların ve nöral devrelerin canlılarda nasıl çalıştığını incelemek için özellikle nematod C. elegans’ta güçlü olmuştur,hayvanlar 4,5,6,7,8,9,10’da davranır, çünkü şeffaf doğaları optik erişim için cerrahi bir işlem gerekmediği anlamına gelir ve hücreye özgü gen promotörleri ilgili hücrelere ekspresyonu hedefler. Bu teknikler genellikle biyolojik, kimyasal ve fiziksel olayları küçük bir fiziksel ölçekte incelemek için hassas bir şekilde kontrol edilen ortamlar sağlayan mikroakışkan cihazlardan yararlanır11,12. Mikroakışkan cihazlar, nöral aktiviteyi ölçmek için bolca bulunur, yeni tasarımlar sürekli geliştirilmektedir ve araştırma laboratuvarında kolayca üretilmektedir. Bununla birlikte, birçok tasarım aynı anda tek bir hayvanı yakalar ve deneysel verimi 7,9,13 ile sınırlar. Nöral tepkiler genellikle önceki deneyimlerdeki farklılıklar, stres veya açlık gibi içsel durumlar veya gen ekspresyon seviyeleri gibi stokastik faktörler nedeniyle hayvanlar arasında önemli ölçüde değişir. Bu farklılıklar, aynı anda birçok hayvanı uyarabilen ve gözlemleyebilen ve bireylerden bilgi çıkarabilen yöntemlere ihtiyaç duymaktadır4.
Ek olarak, bazı nöromodülatör fenomenler sadece zamansal inhibisyon14 gibi spesifik stimülasyon koşulları altında belirginleşir; bu, stimülasyon hızlı bir şekilde art arda gerçekleştiğinde yanıtların kısa sürede bastırılmasını ifade eder. Elektrofizyolojik sistemler, bu amaçla geniş bir uyaran alanı boyunca nöral aktiviteyi yönlendirebilir, örneğin elektrik darbe akımını, voltajı, frekansı, dalga formunu, görev döngüsünü ve periyodik uyaran trenlerinin zamanlamasını modüle edebilir. Doğal olarak tespit edilen uyaranlar veya optogenetik sistemler tarafından dolaylı stimülasyon, benzer bir kontrol mekanizması genişliğinden yararlanacaktır. Şu anda, birçok doğal uyaran, esneklik eklemek için yavaş olan ticari sistemler kullanılarak, koku sunumu ve giderilmesi gibi basit bir “açma-kapama” şeklinde sunulmaktadır. Bununla birlikte, ucuz mikrodenetleyiciler artık araştırmacıların ihtiyaçlarına göre özelleştirilebilecek şekilde çeşitli uyaran türlerinin dağıtımını otomatikleştirebilir. Mikroakışkanlarla birleştirildiğinde, bu sistemler deneysel verimi ve esnekliği artırma hedefine ulaşmıştır ve çeşitli hassas uyaranlara sinirsel tepkilerin birçok hayvanda aynı anda ölçülmesine izin vermiştir 4,6. Multimodal stimülasyon, nöronal devreyi daha fazla sorgulamak için kullanılabilir, örneğin ilaç maruziyeti gibi ortogonal bir pertürbasyondan önce, sırasında ve sonrasında sürekli olarak uyarılırken nöral uyarılabilirlikteki değişiklikleri izleyerek4. Ucuz, açık mikroskopi sistemlerinin faydaları, bilimsel araştırmayı ilerletmek için açıktır, ancak pratikte, parça tedariki, inşaat ve performans doğrulamasına duyulan ihtiyaç, bu tekniklerin benimsenmesini engelleyebilir.
Bu protokol, bu teknik zorlukların bazılarını hafifletmeyi amaçlamaktadır. Önceki protokoller mikroakışkan cihaz kullanımı ve temel stimülasyon 9,15,17’ye odaklanmış olsa da, burada C. elegans veya daha önce tarif edilen mikroakışkan cihazları kullanan diğer küçük organizmalarda nöral görüntüleme için esnek, otomatik, multimodal bir uyaran dağıtım sisteminin inşasını ve kullanımını açıklıyoruz4. Açık kaynaklı sistem, deneyleri tanımlamak için basit metin dosyaları aracılığıyla programlanır ve NeuroTracker veri analiz programı, sinirsel aktivite verilerini mikroskop videolarından yarı otomatik olarak çıkarır. Bu sistemi, farklı gıda kokularına yanıt olarak veya optogenetik ışığa duyarlı iyon kanallarını eksprese ederken ışığa tepki olarak depolarize olan kemosensoriyel nöron AWA’yı kullanarak zamansal inhibisyon, disinhibisyon ve uyaran çapraz konuşmasını değerlendirme örnekleriyle gösteriyoruz5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, farklı uyaran modellerinin geçici olarak hassas bir şekilde verilmesini kullanarak nöral aktivite fenomenlerinin değerlendirilmesi için açık erişimli bir mikroskopi sistemi tarif ediyoruz. Mikroakışkan platform, onlarca hayvanı mikroskop görüş alanında tutarken tekrarlanabilir uyaranlar sağlar. Birkaç ticari mikroskopi yazılım paketi, çeşitli uyaran zamanlama modellerinin ve genellikle her bir modelin veya tescilli dosya formatlarının manuel olarak girilmesini gerektiren programlar?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu protokolleri test ettiği ve makaleyi incelediği için Fox Avery’ye ve programlama yardımı için Eric Hall’a teşekkür ederiz. Burada sunulan yöntemlerin finansmanı kısmen Ulusal Bilim Vakfı 1724026 (D.R.A.) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -. H. Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity. Neurophotonics. 1, 025008 (2014).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 4266-4273 (2013).
- Larsch, J., et al. A circuit for gradient climbing in C. elegans chemotaxis. Cell Reports. 12 (11), 1748-1760 (2015).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Automated fluid delivery from multiwell plates to microfluidic devices for high-throughput experiments and microscopy. Scientific Reports. 8, 6217 (2018).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Lawler, D. E., et al. Sleep analysis in adult C. elegans reveals state-dependent alteration of neural and behavioral responses. The Journal of Neuroscience. 41 (9), 1892-1907 (2021).
- Reilly, D. K., Lawler, D. E., Albrecht, D. R., Srinivasan, J. Using an adapted microfluidic olfactory chip for the imaging of neuronal activity in response to pheromones in male C. elegans head neurons. Journal of Visualized Experiments. (127), e56026 (2017).
- Han, X., et al. A polymer index-matched to water enables diverse applications in fluorescence microscopy. Lab on a Chip. 21 (8), 1549-1562 (2021).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Albrecht, D. R., Bargmann, C. I. High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments. Nature Methods. 8 (7), 599-605 (2011).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Cohen, R. A., Kreutzer, J. S., DeLuca, J., Caplan, B. Temporal Inhibition. Encyclopedia of Clinical Neuropsychology. , 2480-2481 (2011).
- Lawler, D. E., Albrecht, D. R. Monitoring neural activity during sleep/wake events in adult C. elegans by automated sleep detection and stimulation. STAR Protocols. 3 (3), 101532 (2022).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), 10 (2014).
- Lagoy, R. C., Larsen, E., Lawler, D., White, H., Albrecht, D. R. Microfluidic devices for behavioral analysis, microscopy, and neuronal imaging in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 2468, 293-318 (2022).
- NeuroTracker. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- NeuroTracker User Guide. GitHub Available from: https://github.com/albrechtLab/Neurotracker (2022)
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Galotto, G. Chitin triggers calcium-mediated immune response in the plant model Physcomitrella patens. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (7), 911-920 (2020).
- Qian, X., Song, H., Ming, G. Brain organoids: Advances, applications and challenges. Development. 146 (8), 166074 (2019).
- Ventimiglia, D., Bargmann, C. I. Diverse modes of synaptic signaling, regulation, and plasticity distinguish two classes of C. elegans glutamatergic neurons. eLife. 6, 31234 (2017).
- Boulin, T. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).
