여러 개의 작은 유기체에서 자동화된 다중 모드 자극 및 동시 신경 기록
Summary
우리는 많은 Caenorhabditis elegans 벌레의 유연한 화학적 및 다중 모드 자극과 동시 신경 활동의 기록 방법을 제시합니다. 이 방법은 미세 유체 공학, 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어, 감독 자동화 데이터 분석을 사용하여 적응, 시간적 억제 및 자극 누화와 같은 신경 현상을 측정할 수 있습니다.
Abstract
형광 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표는 개별 뉴런 수준에서 전체 뇌 회로에 이르기까지 신경 역학에 대한 우리의 이해에 크게 기여했습니다. 그러나 신경 반응은 이전 경험, 내부 상태 또는 확률적 요인으로 인해 달라질 수 있으므로 한 번에 많은 개인의 신경 기능을 평가할 수 있는 방법이 필요합니다. 대부분의 기록 기술은 한 번에 한 마리의 동물을 검사하는 반면, 우리는 광시야 현미경을 사용하여 한 번에 수십 개의 예쁜꼬마선충 또는 기타 서브밀리미터 규모의 유기체로 신경 기록을 확장하는 방법을 설명합니다. 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어는 화학적, 광학적, 기계적, 열적 및 전자기 자극을 포함한 다양한 자극 유형의 강도와 타이밍을 제어하는 완전 자동화된 실험을 프로그래밍하는 데 뛰어난 유연성을 제공합니다. 특히, 미세유체 유동 장치는 초 미만의 시간 분해능으로 화학감각 자극의 정밀하고 반복 가능하며 정량적인 제어를 제공합니다. 그런 다음 NeuroTracker 반자동 데이터 분석 파이프라인은 개별 및 인구 전체의 신경 반응을 추출하여 신경 흥분성 및 역학의 기능적 변화를 발견합니다. 이 논문은 뉴런 적응, 시간적 억제 및 자극 누화를 측정하는 예를 제시합니다. 이러한 기술은 자극의 정밀도와 반복성을 높이고, 개체군 변동성을 탐색할 수 있으며, 세포 및 오가노이드에서 전체 유기체 및 식물에 이르기까지 소규모 생물 시스템의 다른 동적 형광 신호로 일반화할 수 있습니다.
Introduction
칼슘 이미징 기술은 형광 현미경 및 표적 세포에서 발현된 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용하여 실시간으로 생체 내 신경 역학을 비침습적으로 기록할 수 있게 해주었다 1,2,3. 이러한 센서는 일반적으로 GFP-칼모듈린-M13 펩타이드(GCaMP) 패밀리와 같은 녹색 형광 단백질(GFP)을 사용하여 신경 활성화 및 세포 내 칼슘 수치 상승 시 형광 강도를 증가시킵니다. 칼슘 이미징은 선충 C. elegans에서 뉴런과 신경 회로가 살아 있고 행동하는 동물 4,5,6,7,8,9,10에서 어떻게 기능하는지 조사하는 데 특히 강력했습니다. 이러한 기술은 종종 작은 물리적 규모에서 생물학적, 화학적, 물리적 현상을 연구하기 위해 정밀하게 제어된 환경을 제공하는 미세유체 장치를 사용한다11,12. 신경 활동을 측정하기 위한 미세 유체 장치는 풍부하며 새로운 디자인이 지속적으로 개발 중이며 연구실에서 쉽게 제작할 수 있습니다. 그러나 많은 설계가 한 번에 한 마리의 동물을 가두어 실험 처리량을 7,9,13으로 제한합니다. 신경 반응은 종종 이전 경험의 차이, 스트레스 또는 배고픔과 같은 내부 상태 또는 유전자 발현 수준과 같은 확률적 요인으로 인해 동물마다 크게 다릅니다. 이러한 차이로 인해 많은 동물을 자극하고 관찰하는 동시에 개체로부터 정보를 추출할 수 있는 방법이 필요합니다4.
또한, 특정 신경조절 현상은 자극이 빠르게 연속적으로 발생할 때 반응의 짧은 억제를 의미하는 시간적 억제(temporal inhibition)14와 같은 특정 자극 조건에서만 명백해진다. 전기생리학적 시스템은 이러한 목적을 위해 광범위한 자극 공간에서 신경 활동을 유도할 수 있으며, 예를 들어 주기적 자극 트레인의 전기 펄스 전류, 전압, 주파수, 파형, 듀티 사이클 및 타이밍을 변조할 수 있습니다. 자연적으로 감지된 자극 또는 광유전학적 시스템에 의한 간접 자극은 유사한 범위의 제어 메커니즘으로부터 이익을 얻을 것입니다. 현재, 많은 자연적 자극은 유연성을 추가하는 데 느린 상용 시스템을 사용하여 냄새 표현 및 제거와 같은 간단한 “온-오프” 방식으로 제공됩니다. 그러나 저렴한 마이크로 컨트롤러는 이제 연구원의 요구에 맞게 사용자 정의 할 수있는 방식으로 여러 유형의 자극 전달을 자동화 할 수 있습니다. 미세 유체 공학과 결합 된이 시스템은 실험 처리량과 유연성을 증가시켜 많은 동물에서 다양한 정밀 자극에 대한 신경 반응을 동시에 측정 할 수 있도록하는 목표를 달성했습니다 4,6. 멀티모달 자극(multimodal stimulation)은 약물 노출과 같은 직교 섭동 전, 도중, 후에 지속적으로 자극할 때 신경 흥분성의 변화를 모니터링하는 것과 같이 신경 회로를 추가로 조사하는 데 사용할 수 있다4. 저렴한 개방형 현미경 시스템의 이점은 과학 연구를 발전시키는 데 분명하지만 실제로는 부품 소싱, 구성 및 성능 검증의 필요성이 이러한 기술의 채택을 방해할 수 있습니다.
이 프로토콜은 이러한 기술적 문제 중 일부를 완화하는 것을 목표로 합니다. 이전 프로토콜은 미세유체 장치 사용 및 기본 자극에 초점을 맞추었지만 9,15,17, 여기서는 이전에 설명한 미세유체 장치 4를 사용하는 예쁜꼬마선충 또는 기타 작은 유기체의 신경 이미징을 위한 유연하고 자동화된 다중 모드 자극 전달 시스템의 구성 및 사용을 설명합니다. 오픈 소스 시스템은 실험을 정의하기 위해 간단한 텍스트 파일을 통해 프로그래밍되며 NeuroTracker 데이터 분석 프로그램은 현미경 비디오에서 신경 활동 데이터를 반자동으로 추출합니다. 우리는 광유전학적 빛에 민감한 이온 채널을 발현할 때 다양한 음식 냄새에 반응하거나 빛에 반응하여 탈분극하는 화학감각 뉴런 AWA를 사용하여 시간적 억제, 탈억제 및 자극 누화를 평가하는 예를 통해 이 시스템을 보여줍니다 5,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 우리는 다양한 자극 패턴의 시간적으로 정확한 전달을 사용하여 신경 활동 현상을 평가하기 위한 개방형 현미경 시스템을 설명합니다. 미세 유체 플랫폼은 수십 마리의 동물을 현미경 시야에 유지하면서 반복 가능한 자극을 전달합니다. 다양한 자극 타이밍 패턴을 쉽게 프로그래밍할 수 있는 상용 현미경 소프트웨어 패키지는 거의 없으며, 각 패턴 또는 독점 파일 형식을 수동으…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이러한 프로토콜을 테스트하고 원고를 검토해 주신 Fox Avery와 프로그래밍 지원을 요청해 주신 Eric Hall에게 감사드립니다. 본원에 제시된 방법에 대한 자금은 미국 국립과학재단(National Science Foundation 1724026, D.R.A.)에 의해 부분적으로 제공되었다.
Materials
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
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