Predição de Farmacologia de Rede e Validação Metabolômica do Mecanismo de Fructus Phyllanthi contra Hiperlipidemia
Summary
O presente protocolo descreve uma estratégia integrada para explorar os principais alvos e mecanismos de Fructus Phyllanthi contra hiperlipidemia baseada na predição de farmacologia de rede e verificação metabolômica.
Abstract
A hiperlipidemia tornou-se um dos principais fatores de risco para doenças cardiovasculares e lesões hepáticas em todo o mundo. Fructus Phyllanthi (FP) é uma droga eficaz contra a hiperlipidemia nas teorias da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) e da Medicina Indiana, porém o mecanismo potencial requer maior exploração. A presente pesquisa tem como objetivo revelar o mecanismo do PF contra hiperlipidemia a partir de uma estratégia integrada combinando predição farmacológica de rede com validação metabolômica. Um modelo de camundongos induzidos por dieta hiperlipídica (DHL) foi estabelecido avaliando os níveis de lipídios plasmáticos, incluindo colesterol total (CT), triglicérides (TG), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) e colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C). A farmacologia de rede foi aplicada para descobrir os princípios ativos do PF e potenciais alvos contra a hiperlipidemia. Metabolômica do plasma e fígado foi realizada para identificar metabólitos diferenciais e suas vias correspondentes entre o grupo normal, grupo modelo e grupo intervenção. A relação entre farmacologia de rede e metabolômica foi construída para obter uma visão abrangente do processo de PF contra hiperlipidemia. As proteínas-alvo obtidas foram verificadas por acoplamento molecular. Esses resultados refletiram que o PF melhorou os níveis de lipídios plasmáticos e a lesão hepática da hiperlipidemia induzida por uma DH. Ácido gálico, quercetina e beta-sitosterol em FP foram demonstrados como os principais compostos ativos. Um total de 16 e seis potenciais metabólitos diferenciais no plasma e fígado, respectivamente, foram encontrados envolvidos nos efeitos terapêuticos do PF contra a hiperlipidemia por metabolômica. Além disso, a análise de integração indicou que os efeitos da intervenção estavam associados com CYP1A1, AChE e MGAM, bem como o ajuste de L-quinurenina, corticosterona, acetilcolina e rafinose, envolvendo principalmente a via do metabolismo do triptofano. O acoplamento molecular garantiu que os ingredientes acima atuando em alvos proteicos relacionados à hiperlipidemia desempenhassem um papel fundamental na redução de lipídios. Em síntese, esta pesquisa proporcionou uma nova possibilidade para a prevenção e tratamento da hiperlipidemia.
Introduction
A hiperlipidemia é uma doença metabólica comum e de sérios impactos na saúde humana, sendo também o principal fator de risco para doençascardiovasculares1. Recentemente, tem havido uma tendência de queda relacionada à idade para essa doença, e pessoas mais jovens tornaram-se mais suscetíveis devido a estilos de vida irregulares de longo prazo e hábitos alimentares não saudáveis2. Na clínica, vários medicamentos têm sido utilizados para tratar a hiperlipidemia. Por exemplo, uma das drogas mais comumente usadas para pacientes com hiperlipidemia e distúrbios ateroscleróticos relacionados são as estatinas. Entretanto, o uso prolongado de estatinas apresenta efeitos colaterais que não podem ser negligenciados, os quais levam a um prognóstico ruim, como intolerância, resistência ao tratamento e eventos adversos 3,4. Essas deficiências tornaram-se dores adicionais para pacientes com hiperlipidemia. Portanto, novos tratamentos para eficácia hipolipemiante estável e menos efeitos colaterais devem ser propostos.
A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) tem sido amplamente utilizada no tratamento de doenças devido à sua boa eficácia e poucos efeitos colaterais5. Fructus Phyllanthi (FP), fruto seco de Phyllanthus emblica Linn. (popularmente conhecida como amla berry ou groselha indiana), é um famoso medicamento e material homólogo alimentar dos medicamentos tradicionais chineses e indianos 6,7. Este medicamento tem sido utilizado para limpar o calor, resfriar o sangue e promover a digestão, de acordo com as teorias da MTC8. Estudos farmacológicos modernos têm demonstrado que o FP é rico em compostos bioativos como ácidos gálicos, ácidos elágicos e quercetina9, que são responsáveis por uma gama de propriedades biológicas multifacetadas, atuando como antioxidante, anti-inflamatório, proteção hepática, anti-hipolipidaemic, e assim por diante10. Pesquisas recentes também mostraram que o PF poderia efetivamente regular os lipídios sanguíneos de pacientes com hiperlipidemia. Por exemplo, Variya et al.11 demonstraram que o suco de fruta FP e seu principal ingrediente químico ácido gálico podem diminuir o colesterol plasmático e reduzir a infiltração de óleo no fígado e na aorta. A eficácia terapêutica foi relacionada à regulação do PF em aumentar a expressão do receptor alfa ativado por proliferadores de peroxissoma e diminuir a atividade lipogênica hepática. No entanto, o mecanismo subjacente do PF na melhora da hiperlipidemia deve ser mais investigado, pois seus ingredientes bioativos são bastante extensos. Procuramos explorar o mecanismo potencial da eficácia terapêutica do FP, que pode ser benéfico para o desenvolvimento e utilização deste medicamento.
Atualmente, a farmacologia de redes é considerada uma técnica holística e eficiente para estudar o mecanismo terapêutico da MTC. Em vez de procurar genes causadores de doenças únicas e drogas que tratam apenas um alvo individual, uma rede completa de fármacos-ingredientes-genes-doenças é construída para encontrar o mecanismo multi-alvo do medicamento multiingrediente em relação ao seu tratamento abrangente12. Esta técnica é especialmente adequada para MTC, pois suas composições químicas são maciças. Infelizmente, a farmacologia de rede só pode ser usada para prever alvos afetados por ingredientes químicos em teoria. Os metabólitos endógenos no modelo de doença devem ser observados para validar a eficácia da farmacologia da rede. O método metabolômico, que surge com o desenvolvimento da biologia de sistemas, é uma importante ferramenta para o monitoramento das alterações nos metabólitosendógenos13. As mudanças nos metabólitos refletem as mudanças no estado estacionário do hospedeiro, o que também é um indicador importante para o estudo do mecanismo interno. Alguns pesquisadores conseguiram integrar farmacologia e metabolômica de redes para explorar o mecanismo de interação entre drogas e doenças14,15.
Este artigo explora as bases mecanicistas do PF contra a hiperlipidemia integrando farmacologia de rede e técnicas metabolômicas. A farmacologia de rede foi aplicada para analisar a relação entre os principais princípios ativos do PF e alvos moleculares para hiperlipidemia. Posteriormente, foi realizada metabolômica para observar a alteração de metabólitos endógenos no modelo animal, o que pode explicar as ações da medicina em nível metabólico. Em comparação com a aplicação da farmacologia de rede ou metabonômica isoladamente, esta análise integrada forneceu um mecanismo de pesquisa mais específico e abrangente. Adicionalmente, a estratégia de acoplamento molecular foi utilizada para analisar a interação entre ingredientes ativos e proteínas-chave. Em geral, essa abordagem integrada poderia compensar a falta de evidências experimentais para farmacologia de rede e a falta de um mecanismo endógeno para o método metabolômico, e pode ser usada para a análise do mecanismo terapêutico da medicina natural. O fluxograma esquemático principal do protocolo é mostrado na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nos últimos anos, a taxa de incidência de hiperlipidemia vem aumentando, principalmente devido a hábitos alimentares não saudáveis a longo prazo. A MTC e seus ingredientes químicos possuem diversas atividades farmacológicas, as quais têm sido amplamente estudadas nos últimos anos37,38. O PF é um tipo de recurso frutífero, utilizado tanto como medicamento quanto como alimento, e tem um importante potencial para o tratamento da hiperlipidemia. Entretanto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela Equipe de Desenvolvimento e Inovação de Produtos da TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) e Research on New Business Cross-border Integration of “Health Preservation and Rehabilitation+”.
Materials
| 101-3B Oven | Luyue Instrument and Equipment Factory | ||
| 80312/80302 Glass Slide | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | ||
| 80340-1630 Cover Slip | Jiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD | ||
| AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm) | Thermo Fisher Scientific | ||
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A998 | Version 1.5.6 |
| ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) | Thermo Fisher Scientific | ||
| Aethanol | Fisher Chemical | A995 | Version 3.0 |
| Ammonia Solution | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1336-21-6 | Version 3.9.1 |
| AutoDockTools | Scripps Institution of Oceanography | ||
| BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection System | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | ||
| Compound Discoverer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | ||
| DM500 Optical Microscope | Leica | ||
| DV215CD Electronic Balance | Ohaus Corporation ., Ltd | T15A63 | |
| Ethyl Alcohol | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 64-17-5 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A118 | |
| HDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A112-1-1 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Biosharp | BL700B | |
| High Fat Diet | ENSIWEIER | 202211091031 | |
| Hitachi CT15E/CT15RE Centrifuge | Hitachi., Ltd. | ||
| Homogenizer | Oulaibo Technology Co., Ltd | ||
| Hydrochloric Acid | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 7647-01-0 | |
| Image-forming System | LIOO | ||
| JB-L5 Freezer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | ||
| JB-L5 Tissue Embedder | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | ||
| JK-5/6 Microtome | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | ||
| JT-12S Hydroextractor | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | ||
| KQ3200E Ultrasonic Cleaner | Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd | ||
| LDL-C Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
| Male C57BL/6 Mice | SBF Biotechnology Co., Ltd. | Version 2.3.2 | |
| Neutral Balsam | Shanghai Yiyang Instrument Co., Ltd | 10021190865934 | |
| Pure Water | Guangzhou Watson's Food & Beverage Co., Ltd | GB19298 | |
| PyMOL | DeLano Scientific LLC | Version 14.1 | |
| RE-3000 Rotary Evaporator | Yarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd | ||
| RM2016 Pathological Microtome | Shanghai Leica Instruments Co., Ltd | Version 26.0 | |
| SIMCA-P | Umetrics AB | ||
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme., Ltd | 14202220051 | |
| SPSS | International Business Machines Corporation | ||
| TC Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| TG Assay Kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry | Thermo Fisher Scientific | ||
| Vortex Vibrator | Beijing PowerStar Technology Co., Ltd. | LC-Vortex-P1 | |
| Xylene | Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD | 1330-20-7 |
Referências
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