Neste protocolo, descrevemos os procedimentos técnicos para gerar camundongos knockout específicos para tecido adiposo marrom (BAT) utilizando um sistema combinado de RNA guia único (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado (AAV). As etapas descritas incluem o planejamento dos sgRNAs, a preparação das partículas de AAV-sgRNA e a microinjeção de AAV nos lóbulos BAT.
O tecido adiposo marrom (BAT) é um depósito adiposo especializado em dissipação de energia que também pode servir como órgão endócrino através da secreção de moléculas bioativas. A criação de camundongos knockout específicos para MTD é uma das abordagens mais populares para entender a contribuição de um gene de interesse para a regulação de energia mediada por BAT. A estratégia convencional de direcionamento gênico utilizando o sistema Cre-LoxP tem sido a principal abordagem para gerar camundongos knockout tecido-específicos. No entanto, essa abordagem é demorada e tediosa. Aqui, descrevemos um protocolo para o knockout rápido e eficiente de um gene de interesse em MTD usando um sistema combinado de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e RNA guia único (sgRNA) de vírus adenoassociado (AAV). A MTD interescapular está localizada na camada profunda entre os músculos. Assim, as MTD devem ser expostas para injetar o VAT de forma precisa e direta nas MTD dentro do campo visual. O manuseio cirúrgico adequado é crucial para evitar danos aos nervos e vasos simpáticos, como a veia de Sultzer que se conecta à BAT. Para minimizar o dano tecidual, há uma necessidade crítica de entender a localização anatômica tridimensional da MTD e as habilidades cirúrgicas necessárias nas etapas técnicas. Este protocolo destaca os principais procedimentos técnicos, incluindo o projeto de sgRNAs visando o gene de interesse, a preparação de partículas de AAV-sgRNA e a cirurgia para a microinjeção direta de AAV em ambos os lobos BAT para gerar camundongos knockout específicos para BAT, que podem ser amplamente aplicados para estudar as funções biológicas de genes em BAT.
A obesidade está aumentando a uma taxa significativa em todo o mundo, levando a um amplo espectro de doenças metabólicas 1,2,3. O tecido adiposo é fundamental para essas patologias. Os dois tipos funcionalmente distintos de tecido adiposo que existem são o tecido adiposo branco (TAB), que armazena calorias em excesso, e o tecido adiposo marrom (BAT) e sua gordura bege/brite relacionada, que dissipam energia para a termogênese. Embora a MTD tenha sido reconhecida por sua função dissipadora de energia, ela também tem funções endócrinas por meio da produção de moléculas bioativas que regulam o metabolismo em órgãosdistais4,5. Numerosos estudos em roedores têm demonstrado que o aumento da quantidade ou atividade da gordura marrom ou bege leva ao aumento do gasto energético e melhora da sensibilidade à insulina. Em humanos, pessoas com MTD detectável apresentam prevalência significativamente menor de doenças cardiometabólicas6. Assim, as MTD apresentam excelente potencial terapêutico para sequelas metabólicas relacionadas à obesidade 7,8,9.
Para investigar a fisiologia e fisiopatologia do desenvolvimento e função da MTD e elucidar os mecanismos moleculares envolvidos nesses processos, o modelo de camundongos transgênicos específicos para MTD é um método deescolha10. O sistema de recombinação Cre-LoxP é o meio mais comumente usado para produzir camundongos knockout condicionais editando o genoma de camundongos. Esse sistema tem possibilitado a modificação (superexpressão ou knockout) de genes de interesse de forma tecido/célula-específica11. Ele também pode ser utilizado para marcar um tipo específico de célula, expressando um gene repórter fluorescente seletivo.
Recentemente, a abordagem do sistema Cre-LoxP foi desenvolvida combinando a tecnologia CRISPR-Cas9 e o sistema de RNA guia único (sgRNA) do vírus adenoassociado (AAV)12. O sistema CRISPR-Cas9 é uma ferramenta específica e eficiente de edição genética para modificar, regular ou atingir regiões precisas do genoma13. A edição do genoma baseada em CRISPR-Cas9 permite a manipulação genética rápida de loci genômicos porque não requer recombinação homóloga com um vetor de direcionamento genético. As técnicas combinadas de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e AAV-sgRNA permitem que os pesquisadores entendam as funções gênicas com mais precisão, permitindo a investigação do papel de genes de interesse em momentos desejados em tecidos/células. Além disso, essas técnicas combinadas reduzem o tempo e o esforço necessários para gerar camundongos transgênicos e permitem o controle temporal da atividade de CRISPR-Cas9 para edição induzível do genoma em camundongos se uma linhagem Cre induzível for usada14.
Os vetores AAV são sistemas de liberação gênica in vivo seguros e eficazes. No entanto, os AAVs direcionados ao tecido adiposo têm ficado para trás em relação às aplicações em outros tecidos, como cérebro, coração, fígado e músculo15. Devido à eficiência relativamente baixa da transdução e ao tropismo com vetores sorotípicos de ocorrência natural, a entrega de genes guiados por AAV ao tecido adiposo ainda é um desafio15. Nos últimos 5 anos, nós e outros estabelecemos com sucesso maneiras eficazes e minimamente invasivas de entregar genes guiados por AAV no tecido adiposo e criamos modelos em camundongos que nos permitem obter uma compreensão dos genes envolvidos na regulação da função MTD16,17,18,19. Por exemplo, usando AAV8 para entregar sgRNA visando Alox12, que codifica a 12-lipoxigenase (12-LOX), na MTD dos camundongos Ucp1-Cre/Cas9, descobrimos que a MTD ativada produz metabólitos de 12-LOX, a saber, o ácido 12-hidroxi-eicosapentaenóico (12-HEPE) e o ácido 13R, 14S-dihidroxi docosahexaenóico (maresina 2), para regular o metabolismo da glicose e resolver a inflamação associada à obesidade, respectivamente16, 17º. Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo sobre os procedimentos técnicos, particularmente a cirurgia para a microinjeção direta de AAV-sgRNA nos lobos BAT, para gerar camundongos knockout específicos para MTD usando o sistema combinado Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e AAV-sgRNA.
Os métodos publicados existentes para a entrega de genes mediados por AAV para a MTD interescapular não contêm fotos e vídeos detalhados descrevendo as técnicas cirúrgicas e a abordagem para a injeção direta de AAV na BAT. Na maioria dos métodos publicados33,34, o AAV é injetado nos tecidos adiposos ao redor da MTD interescapular em vez da MTD propriamente dita. Assim, existem várias etapas fundamentais nesse protocolo que determinam o sucesso do estud…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado em parte pelos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH) R01DK122808, R01DK102898 e R01DK132469 (para Y.-H.T.), bem como P30DK036836 (para o Centro de Pesquisa em Diabetes do Joslin Diabetes Center). T. T. foi apoiado pela SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japão) e pela American Heart Association grant 903968. Y. Z. foi apoiado pela Charles A. King Trust Fellowship. Agradecemos a Sean D. Kodani pela gentileza de revisar o manuscrito.
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
Recombinant DNA | |||
lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
Experimental Models: Cell Lines | |||
HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
Experimental Models: Organisms/Strains | |||
Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
Others | |||
Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |